黄化对牡丹枝条解剖结构及不定根发生的影响

解梦雨，徐 珂，王心怡，汪 琦，孙 悦，袁 涛

（北京林业大学园林学院，花卉种质创新与分子育种北京市重点试验室，国家花卉工程技术研究中心，城乡生态环境北京试验室，园林环境教育工程研究中心，林木花卉遗传育种教育部重点试验室，北京 100083）

牡丹(Paeonia sect.Moutan)为芍药科(Paeonia‐ceae)芍药属(Paeonia)牡丹组植物统称，是我国的传统名花，全国各地均有栽培。牡丹花朵硕大、色彩艳丽，代表着百姓心中对美好和幸福生活的向往，因而广泛栽植于园林中用于观赏，此外还可用于食用、药用。

目前牡丹常见的育苗方式中，播种主要用于油用、药用和砧木育苗，观赏品种多采用无性繁殖，但牡丹嫁接、分株和压条的繁殖系数较小，扦插繁殖的生根率较低，市场上新、优品种苗木供不应求，也极大地限制了其推广应用。

提高压条和扦插生根率、生根质量的研究主要集中在土壤基质选择、生长调节剂以及枝条处理等，这些技术的促根作用在中华金叶榆(Ulmus pumila)、茶树(Camellia sinensis)、玫瑰(Rosa rugosa)和卫矛(Euonymus alatus)等很多木本植物均较为明显[1-4]。枝条黄化处理是植物繁殖的一项古老技艺，可有效提高核桃(Juglans regia)、榛(Corylus hetero⁃phylla)和苹果(Malus pumila)等木本植物的生根率[5-7]。黄化是植株或植株部分在完全没有光照的情况下生长发育的过程[8]，常见的操作方式有在枝条上贴黑胶等遮光物局部黄化、枝条基部堆土的自然黄化或将整株植株置于黑暗中抽发新梢从而获得黄化的枝条等[9-11]。黄化处理的枝条会出现厚壁组织不发达、枝条木质化程度降低等变化，在四倍体 刺 槐 (Robinia pseudoacacia)、黄 栌 (Cotinus cog⁃gygria)中均观察到该现象[12-13]，但其促进生根的机制仍缺乏深入研究，且黄化处理对牡丹枝条解剖结构以及不定根生根的影响也研究较少。

本文对2个牡丹品种‘洛阳红’‘黄金翠’的当年生枝条基部覆土黄化后，结合枝条环剥和IBA(in‐dole-3-butyric acid，吲哚丁酸)处理，探究黄化处理对牡丹枝条解剖结构、不定根生根率和根系质量的影响。

1.1 试验材料

试材为牡丹品种‘洛阳红’和‘黄金翠’，2019年秋季购于菏泽艳装牡丹科技开发有限公司。株龄4年，植于北京市昌平区白浮村。2020年秋季平茬，仅保留枝条基部1～2个芽。2021年春季，平茬处理的母株从基部萌发新枝，正常养护管理及病虫害防治，选取茎粗和高度较为一致的健壮、无病虫害当年生枝条用于试验。

1.2 试验方法

采用多因素随机区组试验，共4个处理，每个处理重复3次，每个重复15个枝条。

枝条处理：2021年4月10日，在‘洛阳红’‘黄金翠’新枝基部覆土，厚度8～10 cm，确保枝条基部遮光以自然黄化，以此为黄化处理；
枝条基部不覆土为对照处理。2021年6月3日即黄化处理50 d后，对黄化处理和对照枝条进行如下处理：在距离枝条基部2～4 cm处，绕枝条环剥周长的2/3，环剥宽度为1 cm。环剥后，在伤口部位涂抹500 mg/L的IBA溶液，处理完毕后所有试验枝条覆土8～10 cm。

枝条处理部位形态与解剖结构观察：分别于2021年4月20日、5月12日以及6月2日，拍照记录‘洛阳红’‘黄金翠’枝条处理部位形态并取样。取样时，剪取距离枝条基部2～4 cm处的茎段，每次各处理剪取3个。将样品迅速拿回实验室切割为长0.5 cm的茎段，保存至FAA溶液(90 mL 50%酒精；
5 mL 38%甲醛；
5 mL冰醋酸；
5 mL甘油)，48小时后放入甘油FAA混合液(50 mL甘油；
50 mL FAA)中保存60 d，石蜡切片法制片。切片机(RM2235，徕卡)切片，切片厚度为12～14µm，番红-固绿(麦克林)染色，中性树胶封片，在SOPTOP光学显微镜(40×，OD400UHW-P)下观察、拍照。

1.3 田间管理与指标测定

定期检查以保证枝条基部覆土厚度，常规水肥及除草、松土管理。2021年9月27日，除去枝条基部的覆土，统计一级根、二级根（图3所示）数量，测量一级根根长、根直径等指标并计算每一级根上二级根平均数量，将这5个指标视为根系质量。计算生根率，包括一级根生根率(生根枝条数量/处理枝条总数量)、二级根生根率(二级根生根枝条数量/处理枝条总数量)。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 22进行整理和分析。

2.1 枝条外观形态

5月12日观察到‘洛阳红’‘黄金翠’黄化处理部位的枝条颜色偏白、茎皮肉质(图1，D)；
20 d后，黄化处理部位的颜色转为近黑褐色、红褐色(图1，B、F)，黄化部位的节间长度相比对照部位的枝条明显变长(图1，E、F)，且在部分‘洛阳红’黄化枝条基部观察到不定根(图1，C)。对照枝条始终偏绿色，茎皮未肉质化，也未观察到不定根(图1，A、E)。

图1 黄化处理的‘洛阳红’‘黄金翠’枝条外观Figure 1 Etiolation-treated shoots appearance of′Luoyang Hong′and ′Huangjin Cui′

2.2 枝条解剖结构

‘洛阳红’‘黄金翠’枝条的横切面由表皮、皮层和维管柱3部分组成(图2)。最外层表皮细胞呈长方形且排列紧密。表皮以内维管柱以外为皮层，靠近表皮的数层细胞为厚角组织，向内为薄壁组织。牡丹枝条次生生长后，木栓层发生于皮层以内靠近韧皮部的区域，木栓层细胞栓质化后为死细胞，没有胞间隙。维管柱由外向内分别为韧皮部、维管形成层、木质部和髓。

图2 黄化处理的‘洛阳红’‘黄金翠’枝条解剖结构(40×)Figure 2 Etiolation-treated shoots anatomical structure of′Luoyang Hong′and ′Huangjin Cui′(40×)

处理10 d后，枝条黄化部位的皮层细胞中的细胞核逐渐消失，但仍可见部分皮层细胞内的细胞核，此时枝条木质化程度较低；
对照和黄化部位差异较小(图2，A、B、C、D)。

处理30 d后，枝条黄化部位的皮层细胞中细胞核基本消失，厚角组织发育明显，木栓层细胞发育明显约2～3层；
木质部加厚且染色逐渐变深(图2，E、F、G、H)；
此时与对照枝条开始呈现差异，黄化部位的韧皮部增厚明显(图2，F、H)。

处理50 d后，黄化部位和对照枝条的解剖结构差异已非常明显。对照枝条木栓层外的皮层较厚，表皮和皮层细胞呈现较完整的状态，厚角组织细胞壁再次增厚，木栓层细胞约5～6层，木栓层细胞栓质化严重且晶状簇体积累明显(图2，I、K)。黄化部位木栓层外的皮层细胞变得松散，连同表皮与木栓层有分离迹象，近脱落，木栓层细胞约6～7层，整齐地平行圆周排列，木栓层细胞栓质化较轻且晶状簇体积累不明显；
木栓层内的皮层细胞排列疏松、细胞间隙较大、薄壁细胞增多(图2，J、L)。此时在‘黄金翠’枝条的黄化部位中观察到不定根，不定根起源于维管形成层且已经突破表皮(图2，M)。

‘洛阳红’与‘黄金翠’的枝条解剖结构差异始终较小；
在黄化处理50 d后，‘洛阳红’和‘黄金翠’对照枝条的木栓层内皮层厚度约为175、200µm，薄于黄化部位的375、350 µm；
‘洛阳红’和‘黄金翠’对照枝条的韧皮部厚度约为150、175µm，薄于黄化部位的350、300µm；
木质部厚度分别约为600、650 µm，薄于黄化部位中的 750、800 µm(图 2，I、K、J、L)。

2.3 不定根发生情况

枝条经环剥和500 mg/LIBA处理后约115 d，2个品种的不定根发生情况如下：

由表1，经黄化处理的‘洛阳红’和‘黄金翠’枝条的生根指标均优于对照枝条，生根率明显提高，其中‘黄金翠’的一级根生根率为97.8%；
2个品种的一级根平均数量、二级根平均数量、每一级根上二级根平均数量、一级根平均根长和根直径比对照也相应提高，其中黄化处理的‘洛阳红’枝条的一级根平均根长和根直径分别为11.04 cm、1.93 mm，显著高于对照枝条。

表1 黄化处理对‘洛阳红’‘黄金翠’不定根发生的影响Table 1 The effect of etiolation treatment on adventitious rooting of′Luoyang Hong′and ′Huangjin Cui′

‘洛阳红’和‘黄金翠’枝条生根表现差异明显，‘黄金翠’不论是否黄化处理，生根指标均优于‘洛阳红’。‘黄金翠’黄化枝条的一级根生根率、二级根生根率、一级根平均数量、二级根平均数量、每一级根上二级根平均数量、一级根平均根长和根直径在2个品种的各处理中均表现为最佳(图3)。

图3 ‘洛阳红’‘黄金翠’枝条生根Figure 3 Rooted shoots of′Luoyang Hong′and′Huangjin Cui′

本试验中，2个牡丹品种黄化处理部位的枝条形态变化明显，茎皮肉质化、节间变长，与黄栌(Coti⁃nus coggygria)、柚木(Tectona grandis)等植物枝条经黄化处理后呈现的外部形态变化类似[13-14]。然而2个牡丹品种黄化部位的茎干颜色先偏白色、黄化处理50 d后加深为近黑褐色、红褐色，还未见其他植物中有类似的报道，这一现象是否有普遍性及其诱发原因，尚需进一步研究。

黄化处理后的枝条解剖结构出现厚壁组织发育减慢、皮层增厚、薄壁细胞增多以及木栓层发育延迟等现象[13,15-16]，L.A.Biasi[17]认为上述解剖结构变化有利于枝条上不定根发生。本试验中，‘洛阳红’和‘黄金翠’枝条黄化部位与对照相比，木栓层外组织松散、木栓层发育延迟、木栓层内皮层增厚以及皮层细胞疏松且薄壁细胞增多，枝条木质化程度降低，黄化作用使组织保持幼嫩性从而有利于根原基的分化和生长[18]。试验中，首先在‘洛阳红’和‘黄金翠’黄化枝条上观察到不定根，黄化处理启动了根原基发生，缩短了生根时间。从黄化处理50 d后的解剖结构看，处理部位的木质部和韧皮部更厚，推测维管形成层细胞在黄化处理后更加活跃，故而向外产生了更多韧皮部，向内产生更多木质部细胞，维管形成层正是‘黄金翠’不定根发生部位，因此维管形成层活跃更有利于不定根的发生。朱耀军[19]认为牡丹的不定根与茎的维管连接发生在根原基自维管形成层形成后穿入皮层时间前后，皮层中薄壁细胞参与维管桥的形成，因此认为该试验中发现的木栓层内的皮层薄壁细胞增多可以为不定根发端提供良好环境。黄化处理部位的木栓层栓质化程度较轻，木栓层外组织松散，可减小不定根突破皮层的阻力。本试验发现，尽管‘黄金翠’和‘洛阳红’的解剖结构近似，然而‘黄金翠’不论是否黄化，生根率和生根质量始终优于‘洛阳红’，由此认为本试验中2个牡丹品种间的生根难易与其枝条解剖结构相关不大，今后可深入研究牡丹无性繁殖过程中生根的影响因子。

黄化处理促进植物内源生长素运输及外源生长素的吸收转化，有利于生长素在嫩枝基部积累，有促进不定根发生、提高生根率的作用[20]。黄化处理启动生根后可继续影响其后根系的生长发育指标。如黄化处理提高了楸树(Catalpa bungei)‘豫楸1号’、血皮槭(Acer griseum)、桃(Prunus persica)‘新疆毛桃’、欧榛(Corylus avellana)和平榛(C.heterophylla)等木本植物的扦插生根率[21-24]，提高了苹果(Malus pumila)扦插和橄榄(Canarium album)压条繁殖中不定根生根数量、根长，并加快了不定根发生时间[7,25]。孙文全[20]认为黄化处理能提高插条对外源生长素的敏感性；
B.K.Maynard等[26]在桦叶鹅耳枥(Carpinus betulus)扦插繁殖中发现黄化处理改变了插条对IBA的敏感性；
本试验仅涉及1个IBA浓度，因此牡丹枝条黄化后对生长素的敏感性尚需进一步验证。

IBA处理和枝条环剥对牡丹不定根有促进作用，紫斑牡丹高空压条繁殖时结合环剥和IBA处理，生根率约70%[27]。曾端香等[28]将‘银粉金鳞’‘蓝田玉’等5个牡丹品种黄化后的嫩枝进行扦插，生根率从20.0%～91.0%不等，其中‘银粉金鳞’生根率最高，为91.0%，平均生根数量和根长分别为4.1条、4.9 cm。本研究中，‘黄金翠’和‘洛阳红’枝条黄化处理后生根率和生根质量均优于对照，一级根生根率达97.8%和88.9%，远高于紫斑牡丹(P.rockii)高压繁殖生根率，虽与‘银粉金鳞’扦插生根率相近，但根系质量明显提高。本试验中，当年生牡丹新枝基部约10 cm被土层覆盖，这样的环境给不定根营造了更好的生根条件和更大的生根范围，黄化处理加快了生根，早发生的根系在当年有更长的生长期，进而黄化枝条的生根率和根系质量均明显提高。根系质量影响生根苗的移栽成活率，试验中2个牡丹品种的一、二级根平均生根数量、根长和根直径增加可以更好地吸收土壤中的水分和养分，促进地上部分的生长，也利于种苗移栽。

不定根发生对牡丹压条和扦插繁殖十分重要，本试验2个牡丹品种‘洛阳红’和‘黄金翠’枝条在黄化处理后，黄化部位的木栓层发育延迟、皮层薄壁细胞增多，枝条木质化程度降低，不定根首先在黄化部位出现，再结合枝条环剥和500 mg/LIBA处理，一级根生根率分别达到88.9%和97.8%，根系质量也明显优于对照，因此枝条黄化处理对牡丹的高效繁殖有积极的作用，今后可扩大试验范围，研究不同牡丹品种群间枝条黄化处理效率的差异，及黄化处理时间、枝条造伤方法及不同浓度、不同种类生长素对枝条的生根和种苗移栽成活率的影响。