慢性丙型肝炎患者抗核抗体谱表达与HCV-RNA载量及HCV基因型的关联分析*

杨艳艳 白顺

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的病毒性肝炎，它是由血液传播的丙肝病毒引起的肝脏感染[1-2]。据世界卫生组织（WHO）[3]统计，2015年全球新发175万丙肝病毒感染病例，约有1亿人有HCV暴露的血清学依据，大约有7 100万慢性丙型肝炎患者[4]。据估计，60%～80%的急性HCV感染患者会发展为慢性感染。在20～30年内，大约5%～20%的慢性感染者会发展为肝硬化，1%～5%死于慢性感染（肝硬化和肝细胞癌）[5]。

HCV是一种不稳定的RNA病毒，具有高致突变性，会导致频繁的基因组突变，使其能逃避免疫系统，因此具有很高的慢性进展率[6]。此外，由于HCV的高度异质性，很难开发出有效的疫苗。自身免疫和病毒感染密切相关，丙型肝炎病毒（HCV）被认为是最常与自身免疫特征相关的病毒之一。因此，HCV不仅与慢性肝脏炎症有关，而且与一系列肝外并发症有关。一项荟萃分析报告[7]称，与未感染HCV的人相比，感染HCV的个体发生与免疫失调（混合性冷球蛋白血症、淋巴瘤等）和代谢功能障碍（心血管疾病、2型糖尿病等）相关的肝外表现的风险更高。同时，慢性丙型肝炎患者血清中甲状腺相关抗体[8]、抗核抗体（ANA）、抗平滑肌抗体（SMA）、抗肝肾微粒体抗体（LKM）和抗线粒体抗体（AMA）和类风湿因子（RF）等的表达水平显著升高[9]。

目前有关丙型肝炎病毒RNA与自身抗体的研究主要集中在与甲状腺抗体、AMA、抗可提取核抗原抗体（ENA）、RF、抗肝溶质抗原Ⅰ型抗体（LC-1）和LKM等抗体的关系[10-11]，或者是慢性丙型肝炎HCV基因型与甲状腺功能的关系[12]。而未见慢性丙型肝炎患者抗核抗体谱（LIA-ANAs）的表达与HCV-RNA载量以及HCV基因分型比较分析的相关报道。本研究通过对慢性丙型肝炎患者LIA-ANAs的表达情况，及其与HCV-RNA载量和HCV基因型的相互关系进行分析，旨在探讨慢性丙型肝炎患者产生自身抗体的特征，为临床诊治丙肝患者提供参考。

1 一般资料 选取2019年4月～2022年4月在中国科学技术大学附属第一医院就诊的149例慢性丙型肝炎患者作为研究对象，同时选取93例体检者作为健康对照组，两组的年龄和性别间差异无统计学意义（P＞0.05），比较两组患者的LIA-ANAs结果并进行统计学分析。149例慢性丙型肝炎患者均检测其HCV-RNA载量，同时，对56例HCV-RNA阳性患者进行HCV基因分型并进行分析。本研究经医院论理委员会讨论通过（No.2022-RE-225）。

2 病例纳入标准 所有病例的诊断均符合中华医学会感染病学分会和中华医学会肝病学分会修订的《丙型肝炎防治指南（2019版）》标准[13]，即超过六个月的HCV感染，或者有六个月以上的流行病学史，或感染日期不明，根据症状、体征、实验室、影像学检查结果综合性分析诊断，并排除其他病毒性肝炎及自身免疫性疾病等。

3 方法

3.1 样本采集：将以上符合标准的人群清晨空腹静脉血采集3～5 mL，进行离心、分离血清。未能及时检测的样本需分离血清，放置-20℃保存，7天内检测完毕。

3.2 抗核抗体谱LIA-ANAs的检测采用免疫印迹法：所有符合标准的样本同时检测15种自身抗体：抗核小体抗体（AnuA）、抗史密斯抗体（抗Sm抗体）、抗干燥综合征A型抗原52（SS-A52）、抗组蛋白抗体（AHA）、抗DNA拓扑异构酶I抗体（SCL-70）、抗可溶性核糖核蛋白/史密斯抗体（U1-nRNP/Sm）、抗组氨酰tRNA合成酶抗体 （JO-1）、抗干燥综合征A型抗原60（SS-A60）、着丝点蛋白B（CENPB）、抗干燥综合征B型抗原（SS-B）、双链DNA（ds-DNA）、抗细胞浆抗体（ANCA）、抗中性粒抗体（ANGA）、增殖细胞核抗原（PCNA）、核糖体P蛋白（rRNP）。将待测样本血清按照1∶100倍稀释后按照试剂说明书进行检测。靶抗原部位若出现棕色条带判读为自身抗体阳性。

3.3 ANA检测：检测方法为间接免疫荧光法，试剂产自德国欧蒙公司，待检样本按1∶100稀释后均按照试剂说明书进行检测。使用EUROSTARII荧光显微镜，观察荧光强度和荧光模式。若ANA≥1∶100则判为阳性。

3.4 HCV-RNA检测：丙型肝炎病毒核酸测定采用的是PCR-荧光探针法，HCV-RNA荧光定量PCR仪是上海科华生物有限公司提供的，HCV-RNA检测结果＜80 copies/mL为阴性，HCV-RNA检测结果≥80 copies/mL为阳性。根据试剂盒说明书描述，HCVRNA阳性患者分为高拷贝量（＞1.0×105copies/mL）和低拷贝量（＜1.0×105copies/mL）。所有步骤全部依据广州达安基因试剂说明书操作。

3.5 HCV基因分型检测：HCV基因分型采用的是PCR-反向点杂交法，所使用的仪器为美国ABI公司提供的Prism7300荧光定量PCR仪，恒温震荡水槽，试剂购自广州达安基因公司。

4 统计学处理 采用GraphPrism6.0软件进行分析处理，计量资料以（）表示，两组间均数比较采用t检验；
计数资料用百分率表示，其检验结果使用χ2检验方法进行检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

1 慢性丙型肝炎患者性别、年龄、HCV-RNA载量比较 在149例慢性丙型肝炎患者中，男性48例（32.2%），女性101例（67.8%）；
年龄区间为22～94岁，平均（54.8±14.6）岁。检测患者血清HCV-RNA，HCV-RNA≥80 copies/mL为阳性，HCV-RNA＜80 copies/mL为阴性；
结果显示HCV-RNA阳性患者56例，阴性患者93例。同时选取93例体检者作为健康对照组，其中男性40例（43%），女性53例（57%）；
年龄26～85岁，平均（52.02±13.59）岁。慢性丙肝组与健康对照组间年龄和性别差异无统计学意义（P＞0.05）。

2 LIA-ANAs在慢性丙型肝炎患者血清中的检出情况 149例慢性丙型肝炎患者中，共检出LIA-ANAs阳性者46例，阳性率为30.87%，显著高于健康对照组6.45%（6/93），且差异有统计学意义（χ2=20.24，P＜0.001）。HCV-RNA阳性组与健康对照组相比，阳性率显著高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.001)；
HCV-RNA阴性组与健康对照组相比，阳性率也高于健康对照组，差异也有统计学意义（P=0.001 8）。而149例慢性丙型肝炎患者LIAANAs阳性和阴性组间年龄（t=0.475，P=0.635）、性别（χ2=2.884，P=0.089 5）差异无统计学意义。HCV患者及健康对照组LIA-ANAs表达情况（见下表1）。

表1 慢性丙肝患者及健康对照组LIA-ANAs表达情况比较

另外，在149例慢性丙型肝炎患者中，有56例HCV-RNA为阳性，其中有25例检出LIA-ANAs，阳性率为44.6%（25/56），93例HCV-RNA阴性的慢性丙型肝炎患者中，共有21例检出LIA-ANAs，阳性率为22.6%（21/93），HCV-RNA阳性组患者抗核抗体阳性率44.6%显著高于HCV-RNA阴性组的22.6%，差异有统计学意义（χ2=7.972,P=0.004 8）。（各抗体具体分析比较见表2）。

表2 HCV-RNA阳性组及阴性组患者LIA-ANAs表达情况比较

3 HCV-RNA阳性的慢性丙肝患者病毒载量与LIA-ANA表达情况关系分析 56例HCV-RNA≥80 copies/mL（即HCV-RNA阳性组），93例HCVRNA＜80 copies/mL（即HCV-RNA阴性组）；
进一步将56例HCV-RNA阳性患者分为高拷贝量（＞1.0×105copies/mL）和低拷贝量（＜1.0×105copies/mL）两组后，两组患者的LIA-ANAs检出阳性率间差异无统计学意义（P=0.5789）（见表3）。

表3 慢性丙肝患者HCV-RNA阳性组LIA-ANA表达情况比较

4 慢性丙型肝炎患者血清ANA的检出情况 56例HCV-RNA阳性组丙肝患者检出ANA滴度阳性的有22例，93例HCV-RNA阴性组丙肝患者检出ANA阳性的有27例，表明活动期的慢性丙型肝炎患者的ANA检出阳性率较非活动期的HCV患者高，但ANA滴度差异无统计学意义（见表4）。

表4 慢性丙肝患者ANA检测结果比较

5 HCV-RNA阳性丙肝患者基因分型及对应抗核抗体的表达情况 对56例HCV-RNA阳性的丙型肝炎患者进行基因分型，有45例是1b型，占比80.4%，11例为非1b型，占比19.6%。其中有24例丙肝患者的抗核抗体呈阳性，这24例患者有21例基因分型为1b型，占比87.5%；
3例基因分型为非1b型，占比12.5%；
3例非1b型分别包括1例2a型、1例2b型、1例6a型。抗核抗体检测阳性的患者对应的基因型别最多的是1b型，但差异无统计学意义（见表5）。

表5 56例HCV-RNA阳性丙肝患者基因分型及对应的自身抗体表达情况

HCV嗜淋巴细胞性代表了病毒相关免疫疾病发病机制中最相关的步骤[14]。HCV通过先天性细胞的功能调节和适应性免疫反应损害免疫系统，导致疾病的慢性状态，影响这些患者对抗病毒治疗的反应。HCV感染诱导机体产生自身免疫反应的异质性表现不同，轻者仅表现为患者血清中出现自身抗体，重者可以出现系统性的自身免疫疾病或者器官特异性。

实验、病毒学和临床证据已证明HCV在系统性自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、干燥综合征、溶血性贫血和严重血小板减少症），以及器官特异性自身免疫性疾病，如自身免疫性肝炎[15]、甲状腺疾病[16]和糖尿病[17-20]中的触发作用。据报道，HCV感染的患者自身抗体阳性率较高，其中混合冷球蛋白占60%～80%、RF占70%、抗核抗体20%～40%、抗心磷脂抗体（aCL）20%～15%、抗甲状腺抗体12%和抗平滑肌抗体7%[21-22]。本文通过回顾性分析慢性丙型肝炎患者抗核抗体谱的表达与HCV-RNA载量以及HCV基因分型的关系，探讨活动期的慢性丙型肝炎患者产生自身抗体的特征和意义。

本研究发现，149例慢性丙型肝炎患者中共有46例检出LIA-ANAs，阳性率为30.87%，显著高于健康对照组，差异有统计学意义。这与魏秋静等报道的病毒性肝炎组的ANAs表达率显著性升高的结论是一致的[23]。本研究中149例慢性丙型肝炎患者，有56例HCV-RNA≥80 copies/mL，93例HCV-RNA＜80 copies/mL。LIA-ANAs阳性组的病毒RNA载量高于阴性组，LIA-ANAs阳性组和阴性组间HCV-RNA载量的差异有统计学意义。与贺琤雯等[24]报道的LIA-ANAs阳性组丙肝患者HCV-RNA载量高于阴性组的结论是一致的，提示丙型肝炎病毒感染可伴有明显的自身免疫现象，而患者自身抗体产生的原因可能是患者感染HCV后导致体内细胞膜抗原成分发生改变或者肝脏细胞膜的通透性增加[25]。然而将56例HCV-RNA阳性患者分为高拷贝量和低拷贝量两组后，两组患者的LIAANAs检出阳性率间差异无统计学意义。本研究中，我们纳入的病例数相对较少，慢性丙肝患者自身抗体检出率与HCV-RNA载量之间是否相关还需进一步扩大研究对象来进行验证。

本研究还发现，HCV-RNA阳性组患者抗核抗体阳性率44.6%，显著高于HCV-RNA阴性组的22.6%，差异有统计学意义。而且，HCV-RNA阳性组细胞浆抗体的例数，高于HCV-RNA阴性组，且差异有统计学意义。其余14项抗核抗体的单项抗体，HCV-RNA阳性组和阴性组间差异无统计学意义。HCV-RNA是反应病毒水平的一项重要指标[26-27]，其病毒载量与丙肝的疗效和预后有着密切关系[28]，一些研究表明，这些自身抗体的显著增加可能与更加严重的肝硬化和肝损害有关，并可能是治疗预后差的相关因素[29]。

HCV-RNA阳性组丙肝患者检出ANA滴度阳性例数较HCV-RNA阴性组多，但ANA滴度差异无统计学意义，表明活动期的慢性丙型肝炎患者的ANA检出阳性率较非活动期的HCV患者高，但差异无统计学意义。正如文献中报道慢性丙肝患者丙肝病毒复制能力与自身免疫反应有一定的相关性[30]，本研究结果与这一结论也是较为吻合的。

HCV分为6个主要基因型和多种亚型（如1a、1b、2a等）[31]。基因型1和2主要在西非，而基因型3主要在南亚[32]，基因型4、5和6分别主要在中东和中非、南部非洲和东南亚[32]。不同的HCV基因型和亚型对目前可用的抗病毒药物的耐药程度各不相同，从而使治疗决策以基因型为导向[31，33]。因此，确定感染基因型是HCV治疗的基础，有助于确定使用哪种抗病毒药物、剂量以及治疗持续时间[34]。我国较常见的是1b, 2a, 3a, 3b, 6a型，主要以1b和2a型为主，其中1b型占较大比例[35-36]，本研究中，56例HCV-RNA阳性丙肝患者中有45例为1b型（80.4%）与文献报道比较一致。其中抗核抗体结果为阳性的患者对应的基因型别最多的也是1b型，但差异无统计学意义。这与我们的样本量可能也有一定关系。

在所有LIA-ANAs阳性结果中，检出率最高的

是SSA52，在HCV-RNA阳性组中，25例LIA-ANAs

阳性患者有11例存在SSA52阳性，比例高达48%（11/25）。在HCV-RNA阴性组中，21例LIA-ANAs阳性患者有8例存在SSA52阳性，比例高达38.1%（8/21）。抗SSA52抗体为抗SSA抗体的一种，在多种自身免疫疾病中被检出，尤其在干燥综合征（SS）和系统性红斑狼疮（SLE）中尤为常见，但与干燥综合征关系更加密切，也可见于糖尿病、多种结缔组织病、病毒性肝炎等疾病中[37]。

然而单独 SSA52 抗体阳性仅作为自身免疫性疾病的预警和提示，不具有诊断特异性，需与抗 SSA60抗体、抗SSB抗体及ANA等联合检测可提高SS诊断的特异性和灵敏性。

综上所述，丙型肝炎病毒感染患者血清中抗核抗体阳性率显著升高，且与HCV-RNA载量相关，不同基因型的HCV对治疗药物的敏感程度不同，确定HCV感染者基因型有助于临床治疗和合理用药。因此，在临床上对活动期慢性丙型肝炎患者抗核抗体、HCV-RNA 、基因分型等指标的监测，有利于指导临床医生早期干预以防止并发症的发生。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突