框镜鲤邻单胞菌的分离鉴定与抗菌药物筛选

王玲玲，杜苏兰，侯天牧，雷连成,3，易提林，袁汉文,4*，张付贤,4*

(1.长江大学动物科学学院，湖北荆州 434023；
2.湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北荆州 434023；
3.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062；
4.涝渍灾害与湿地农业湖北省重点实验室，湖北荆州 434023)

类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、邻单胞菌属(PlesiomonasHabs and Schubert，1962)的唯一种，属于革兰氏阴性、氧化酶阳性、兼性厌氧型细菌，最初由Ferguson等从人类粪便中分离得到，归于肠杆菌科，后由于其与宋内志贺氏菌有共同抗原，命名为类志贺邻单胞菌[1-2]。长期以来，邻单胞菌被认为是弧菌科的一部分，但现在它已被重新归类为肠杆菌科成员[3]。类志贺邻单胞菌是一种人-兽-鱼共患病病原，人类主要通过接触受污染的水传播，会导致败血症、脑膜炎、严重的痢疾样腹泻和食物中毒等疾病，因此，该菌引起的疾病受到公共卫生和水产养殖领域的高度关注[4-5]。

框镜鲤(Cyprinuscarpio)属于鲤属(Cyprinus)、鲤科(Cyprinidae)，是欧洲鲤鱼的一个变种，由德国镜鲤经过精心选育而来，是我国东北地区池塘养殖户驯养和养殖鱼的主要品种[6]。框镜鲤与普通鲤鱼相比，具有肉质鲜美、易于驯养、生长速度快等优点，但是容易生病，抵抗力较差[7]，大规模的细菌感染给渔民造成一定的经济损失，已发现框镜鲤会感染嗜水气单胞菌[8]和维氏气单胞菌[9]，但是由类志贺邻单胞菌引起框镜鲤患病的病例尚未见报道。

水产类病害主要以抗生素治疗为主，而不能精准施治或过度使用抗生素，会导致耐药菌株的产生，为临床治疗带来困难，给水产养殖造成食品安全等潜在隐患[10]。所以迫切需要找到替代传统渔类药物的方法，以克服这些缺点。中草药具有无毒、低抗等优点，其本身及其次级代谢产物具有大量的生物活性分子，具有来源广泛、价格低廉、易于获取等特点，与传统渔业用药和疫苗不同，其作为渔用药物已被广泛研究，是新型渔药研发的热点方向[11]。

目前针对框镜鲤的细菌性疾病研究较少，为了更好地预防和治疗类志贺邻单胞菌引起的框镜鲤患病，本研究通过生理生化分析和分子鉴定对分离株QPB1进行鉴定，结合分离株QPB1的药物敏感性、所携带的耐药基因，筛选出有效的抗生素及中药，为本次养殖场暴发疫情的精准施治提供建议，为该菌所致疾病的防治提供理论依据。

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 患病框镜鲤由湖北荆州某水产养殖企业提供，病鱼体重1.0 kg～1.5 kg。

1.1.2 主要试剂 革兰氏染色剂、胰蛋白胨大豆琼脂(tryptone soy agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(tryptone soy broth，TSB)，北京索莱宝生物科技有限公司产品；
药敏纸片、细菌微量生化管，杭州微生物试剂有限公司产品；
2×PCR Mix酶、DNA Marker DL 2000 ，北京聚合美生物科技有限公司产品；
细菌基因组提取试剂盒，北京天根生化科技有限公司产品；
引物合成及测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要仪器 超净工作台(SW-CJ-2FD)，中国苏州安泰空气技术有限公司产品；
冰箱2℃～4℃，美的集团股份有限公司产品；
微量加样器(2.5 μL，10 μL，20 μL，100 μL，200 μL)，艾本德中国有限公司产品；
电子天平(ME204)，瑞士梅特勒公司产品；
恒温培养摇床(ZQZY-78CN)，上海知楚仪器有限公司产品；
高压蒸汽灭菌锅(YM50FC)，中国上海三申医疗器械有限公司产品；
旋涡混合仪(QL-902)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；
梯度PCR仪(T100)，美国Bio-Rad公司产品；
凝胶成像系统(JS-1800)，上海培清科技有限公司产品；
电泳仪(POWER 600H+HS 120+MINI VE1600)，莱普特科学仪器(北京)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 类志贺邻单胞菌的分离鉴定

1.2.1.1 病原菌的分离 检查记录患病框镜鲤的外观症状，用750 mL/L酒精擦拭病鱼体表进行消毒；
无菌条件下解剖，观察内部组织器官是否有病变；
接种环于体表溃疡深处、患病组织内部取样，划线接种于TSA琼脂培养基上，37℃倒置培养16 h；
挑取单菌落进行纯化培养，观察菌落特性，保存备用。

1.2.1.2 分离株的生理生化鉴定 从体表溃疡深处划线的平板上分离到大小均一的单菌落，命名为QPB1，对分离株进行革兰氏染色后镜检。将氧化酶试纸用蒸馏水浸湿，挑取单菌落，涂在试纸上，在30 s之内变为蓝色或蓝紫色为强阳性，2 min内不变色为阴性。挑取单菌落，接入5 mL的LB液体培养基中，采用37℃、180 r/min的条件摇床过夜培养12 h，取10 μL菌液加入细菌微量生化管中，37℃培养24 h或48 h后进行生理生化分析。

1.2.1.3 16S rRNA鉴定 摇床培养后的菌液用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组，使用通用引物27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT扩增QPB1的16S rRNA基因，PCR产物切胶回收送上海生工生物工程有限公司武汉测序部进行测序；
测序结果在NCBI上进行Blast对测序结果比对分析；
选取同源性较高的序列，利用MEGA 11软件进行多序列比对，采用N-J邻接法构建系统进化树。

1.2.1.4 特异性PCR检测 通过对类志贺邻单胞菌的23S rRNA基因进行特异性扩增，分别检测类志贺邻单胞菌在框镜鲤的肠、肾、鳃、肝、脾中的分布情况，以恒温培养16 h后长出的单菌落为检测模板。参考文献[12]委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司设计合成特异性引物，其序列为PS-F:TCCGAATACCGTAGAGTGCTATCC;PS-R:CTCCCCTAGCCCAATAACACCTAAA，条带大小为284 bp，反应体系 (20 μL)：模板1 μL，2×PCR mix 10 μL，上、下游引物各1 μL、ddH2O 7 μL；
PCR扩增条件：94℃预变性5 min；
94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，31个循环；
72℃延伸10 min。反应后用5 μL产物使用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，恒压120 V电泳25 min。

1.2.2 抗生素药物筛选

1.2.2.1 药敏试验 采用Kirb-Bauer(K-B)纸片扩散法，参照杭州微生物试剂有限公司的药敏试验判断标准来判定QPB1的耐药性。用无菌棉签蘸取菌液，均匀涂布整个TSA培养基表面。待培养基表面稍干后，将药敏纸片贴于培养基表面，置于37℃下16 h后测量抑菌圈直径。

1.2.2.2 QPB1耐药基因检测 参考文献[13-15]设计合成四环素类、磺胺类和MLS(macrolides-lincosamids-streptogramins)类药物耐药基因引物序列(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。反应体系(20 μL)：模板1 μL，2×PCR mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL；
四环素类耐药基因扩增程序为：预变性94℃ 5 min；
变性94℃ 60 s，复性56℃ 60 s，延伸72℃ 60 s，循环数为33；
最后延伸72℃ 10 min；
磺胺类和MLS类耐药基因扩增程序为：预变性94℃ 5 min；
变性94℃ 30 s，复性56℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，循环数为33；
最后延伸72℃ 10 min。

1.2.3 中药抑菌的筛选

1.2.3.1 中药敏感试验 选择黄芩、苏子、独活、款冬花、桑皮、川贝母、天竹黄、大黄、荆芥、半夏、黄连、僵蚕、炙白附子、茯苓、羌活、桔梗、明雄黄、朱砂、枳壳、连翘、板蓝根、鱼腥草、全蝎、野菊花、薄荷、五味子、金银花、五倍子、秦皮、首乌藤、丁香、蒲公英、桑白皮、板蓝根、地榆、槟榔、大青叶、罗汉果、三七、乌梅共39种中药材，参考文献中的方法[16]，取中药粉末2 g，加入40 mL水浸泡1 h后煎煮，沸腾后转文火继续煎煮2 h，后用4层纱布过滤，过滤后的药渣继续加入40 mL水，按上述方法进行煎煮过滤。将2次过滤的药液浓缩为2 mL，最终浓度为1 g/mL。高压灭菌后，放于4℃保存。

使用无菌棉签蘸取菌液均匀涂布在LB平板培养基上，每个培养基上放置4个牛津杯，1个孔放入100 μL的无菌水作为空白对照，其余3个孔加入100 μL制备好的中药药液，于37℃培养16 h，测量抑菌圈直径。

1.2.3.2 测定最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC) 取无菌 96孔板，每孔中加入100 μL的TSB培养基，第1孔中加入100 μL的中药药液(终浓度 500 μg/mL)，从第2孔开始将前一孔中取出100 μL至下一孔，共设10个梯度(500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.625 μg/mL、7.812 5 μg/mL、3.906 25 μg/mL、3.906 25/2 μg/mL、3.906 25/4 μg/mL)，从第10孔中吸出 100 μL弃去，第11孔不加药物，再向各孔中加入 5 μL制备好的菌悬液，第12孔不加菌和药物，每种中药3个重复，无菌水做空白对照。37℃培养24 h，以肉眼观察到没有浑浊的一列为最小抑菌浓度，继续培养，以37℃培养48 h后未见浑浊的孔浓度为最小杀菌浓度。

表1 耐药基因引物序列

2.1 患病框镜鲤临床症状

自然发病框镜鲤表现为浮头和游动无力，反应变慢并伴有摄食减少，体表出现溃烂和少量出血(图1A)，鳃丝泛白(图1B)，腹腔中有积液。

A.体表溃烂;B.鳃丝泛白

2.2 生理生化鉴定结果

2.2.1 细菌分离结果 从体表溃疡处划线平板上对优势菌进行分离纯化，得到纯培养的单菌落QPB1，在37℃培养16 h，可形成表面湿润凸起、白色不透明、有光泽的圆形菌落；
染色镜检观察，显示其为革兰氏阴性杆菌(图2)。

A.QPB1培养基生长形态;B.QPB1革兰氏染色

2.2.2 生化试验结果 生化鉴定发现，分离株QPB1氧化酶、硝酸盐还原为阳性，能利用麦芽糖、半乳糖，精氨酸双水解酶阳性，不能利用阿拉伯糖、甘露醇、蔗糖、棉子糖、山梨醇、鼠李糖，硫化氢反应阴性，葡糖糖不产气(表2)；
参照《伯杰氏系统细菌学手册》，发现QPB1与类志贺邻单胞菌的生化特性相符合，初步判定QPB1为类志贺邻单胞菌。

表2 QPB1和类志贺邻单胞菌生化鉴定结果比较

2.3 16S rRNA鉴定

利用通用引物27F和1492R扩增分离菌株的16S rRNA基因，结果如图3A所示，扩增得到了1443 bp的基因序列，NCBI网站选择Blast进行序列比对，QPB1的基因序列与GenBank中收录的类志贺邻单胞菌(MK397781.1)基因序列的同源性达到99.79%(图3B)；
选择同源性较高的序列构建系统进化树，结果显示进化树中QPB1与类志贺邻单胞菌聚为一支。根据上述结果，进一步确定分离菌株QPB1为类志贺邻单胞菌。

A.通用引物扩增结果；
B.基于16S rRNA序列构建的系统进化树A.Universal primer amplification results; B.Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA sequence

2.4 特异性PCR检测

使用特异性引物对类志贺邻单胞菌的23S rRNA基因进行扩增，结果显示，在患病框镜鲤的肠、鳃、肝和脾中均能扩增出明亮且特异的条带，大小为284 bp，与目的片段大小一致，表示在框镜鲤的肠、鳃、肝和脾中均存在类志贺邻单胞菌(图4)。

M:DL 2 000 DNA Marker;1.阴性对照;2.肠;3.肾;4.鳃;5.肝;6.脾

2.5 药敏试验

采用Kirb-Bauer(K-B)纸片扩散法，参照杭州微生物试剂有限公司的药敏试验判断标准来判定类志贺邻单胞菌的耐药性，结果显示分离株QPB1对庆大霉素、环丙沙星、头孢曲松、苯唑西林、头孢哌酮、氨苄西林、头孢他啶、卡那霉素、头孢呋辛、头孢唑林、诺氟沙星、新霉素和呋喃唑酮敏感，对羧苄西林中度敏感，对红霉素、哌拉西林、四环素、克林霉素、麦迪霉素、万古霉素和复方新诺明耐药(表3)。

表3 类志贺邻单胞菌药敏试验结果

2.6 耐药基因检测

通过PCR对QPB1所携带的耐药基因进行扩增，结果显示tetA、tetM、sulⅠ、sulⅡ扩增出特异性条带，大小约为730 bp、580 bp、822 bp 和722 bp，与预期片段大小相符，耐药基因tetC、erm(F)、ere(D)、lnu(H)均未检出(图5)。

2～6.阴性对照;8～12.为细菌检测2-6.Negative controls;8-12.Bacterial detection

2.7 中药抑菌试验

中药抑制QPB1试验结果为丁香、连翘、黄连、五倍子、黄芩、荆芥、地榆、首乌藤、大黄、野菊花和乌梅对QPB1表现出明显的抑制作用，抑菌圈直径均大于11 mm。黄连和乌梅的最小抑菌浓度为3.906 25 μg/mL，最小杀菌浓度为7.812 5 μg/mL，其余药物的最小抑菌和最小杀菌浓度为7.812 5 μg/mL～500 μg/mL(表4)。

表4 中药抑菌结果

类志贺邻单胞菌广泛分布于自然界，主要储存地为水生环境，鱼类是其常见宿主，也是一种人-兽-鱼共患病原菌[17]。本研究中类志贺邻单胞菌分离自荆州区某水产养殖企业患病框镜鲤体内。首先通过对病鱼体表观察，发现自然发病框镜鲤表现为反应迟钝，摄食减少，伴有腹水，肛门红肿，体表有溃疡；
分析框镜鲤整体病变，发现与类志贺邻单胞菌引起的病理现象高度相似，因此对病鱼的体表、腮、腹腔积液、肠、肝等进行了细菌分离，对所分离出的优势菌落纯化后，进行生理生化鉴定，鉴定结果与前人对类志贺邻单胞菌的研究结果一致[18-19]；
测序鉴定该菌株的基因序列与类志贺邻单胞菌(MK397781.1)基因序列同源性为99.86%，结合生理生化特性和分子特征分析确定菌株QPB1为类志贺邻单胞菌。通过对类志贺邻单胞菌的23S rRNA基因进行特异性扩增发现在患病框镜鲤的肠、鳃丝和肝中均存在类志贺邻单胞菌。

在水产养殖中，治疗细菌感染目前主要以抗生素为主，对于抗生素的使用应该标准化、合理化，防止滥用的情况发生。为了更好的指导该养殖场合理用药，减少框镜鲤伤亡，本研究对该菌株的耐药性进行了检测，发现其对红霉素、哌拉西林、四环素、克林霉素、麦迪霉素、万古霉素和复方新诺明耐药，对庆大霉素、环丙沙星、头孢曲松、苯唑西林、头孢哌酮、氨苄西林、头孢他啶、卡那霉素、头孢呋辛、头孢唑林、诺氟沙星、新霉素、呋喃唑酮敏感，对羧苄西林中度敏感，并通过耐药基因筛查证实菌株QPB1含有磺胺类和四环素类耐药基因，因此该养殖场可在治疗细菌感染中避免此类抗生素的使用。分离株QPB1的药敏试验与其他研究人员的试验结果存在差异[20-22]，这可能是由于时间、地区以及抗生素使用史有关，也提示在临床治疗中要重视药物的敏感性，精准用药。

利用中药治疗水产类细菌病的已多有报道[23-25]，测定的中药最小抑菌浓度和最小杀菌浓度对指导临床用药有一定的参考意义。赖晓健等研究人员研究了10味中药和14种复方药对类志贺邻单胞菌的体外抑菌作用，结果表明，10味中药均有较好的抑菌效果，其MIC和MBC范围为2 mg/mL～24 mg/mL，其中五倍子、丁香和生地榆的效果最好[26]。本研究对从框镜鲤体内分离的类志贺邻单胞菌进行中药抑制试验，筛选到丁香、连翘、黄连、五倍子、黄芩、荆芥、地榆、首乌藤、大黄(熟)、野菊花和乌梅对类志贺邻单胞菌分离株表现出明显的抑制作用，其中黄连、乌梅、野菊花和大黄抑菌效果最为显著；
与前人的研究结果存在差异可能是由于实验方法、条件等不一致，所试菌株毒力、药物采集地区、季节、部位(根、茎、叶、花、果实、种子)、植物年龄(多年生植物药)、贮藏炮制方法均可能影响实验结果的差异[27]。本研究对从患病框镜鲤中分离出来的类志贺邻单胞菌进行抗菌药物的筛选，结合中药体外抑菌试验结果，为水产养殖企业精准施治提供指导意见。目前，本研究针对中药对类志贺邻单胞菌的抑制作用仅进行了体外试验，由于临床试验的局限性尚未进行体内试验，后续将针对中药单方及复方用药进行鱼体内试验，为此后企业开展联合用药提供理论基础。