生物杀菌剂对草莓枯萎病菌室内抑菌活性的测定

魏嘉怡，史芳芳，周明冬

（1江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；
2新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所，新疆 乌鲁木齐 830088；
3新疆农业生态与资源保护站，新疆 乌鲁木齐 830006）

草莓（Fragaria×ananassaDuch.）属蔷薇科草莓属多年生草本植物，因其色泽鲜艳，果实柔软多汁，香味浓郁，酸甜可口，富含丰富的营养物质和维生素C，并含有可抑制癌细胞生长的有效成分[1]，而深受国内外消费者喜爱。近年来，随草莓产业的快速发展，草莓连作病害现象日趋严重，其中草莓枯萎病是主要的土传病害之一。草莓枯萎病是由尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporumf.sp.fragariae）从草莓根部侵染引起的系统性病害[2]，会导致草莓根部坏死，生长不良，叶无光泽，最后引起叶片萎蔫直至植株枯萎死亡。该病害会使草莓产量和品质大幅降低，严重危害草莓产业持续、健康、稳定地发展[3]。

目前，国内草莓枯萎病的防治方法有农业防治、物理防治、化学防治和生物防治等。农业防治包括作物轮作、脱毒种苗移栽以及选育抗病品种等，但因生产成本高、劳动强度大等因素，并未得到广泛应用；
物理防治主要是高温土壤消毒技术，即利用草莓病原菌在高温环境下难以生长的特点，通过高温暴晒土壤达到消毒杀菌的目的；
化学防治则是使用一些化学试剂来控制病原菌的生长，但其不仅会给消费者的食品安全带来威胁，而且大量使用农药还会对环境造成不良影响，所以不宜推广使用。因此，生产中需要寻找一些对植物无害或有益、却能抑制土壤中病原生物生长代谢的生物，利用生物防治来减少病虫害的发生或降低病害的发展速率，这无疑是最好的选择。生物防治对环境中的有益微生物影响不大，不仅遏制病虫害再猖獗，而且还具有防治成本低、增产增收、不污染环境等优点，最重要的是对人畜植物无害[4]。因此，利用微生物及其代谢产物代替化学试剂防治草莓枯萎病已成为主要发展方向。本文采用菌丝生长速率法，测定12种生物杀菌剂对草莓枯萎病的室内抑菌活性，筛选出防治草莓枯萎病的最适杀菌剂类型、配置及浓度，为草莓枯萎病的防治和新型生物药剂的研发提供理论依据。

1.1 试验材料

1.1.1 培养基

马铃薯培养基（PDA）[5]，用于草莓枯萎病的分离、保存以及毒力测定。

1.1.2 供试菌株

草莓枯萎病菌采自新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所草莓种苗繁育基地。在实验室进行分离、鉴定后，按柯赫氏法则验证并将菌株接种到PDA斜面上，于4℃医用恒温箱内保存备用。

1.1.3 参试药剂

1.1.3 .1粉剂型生物杀菌剂

（1）1×109CFU·g-1胶冻样类芽孢杆菌（Bacillus jelly）·枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），又名稼碧乐（复合型）。（2）1×1011CFU·g-1枯草芽孢杆菌，又名冠蓝（单一型）。（3）6%春雷霉素（kasugamycin）（抗生素型）。（4）1×109CFU·g-1枯草芽孢杆菌·胶冻样类芽孢杆菌，又名菌益（复合型）。以上4种菌剂均由武汉科诺生物科技股份有限公司生产。（5）1×106个孢子·g-1寡雄腐霉菌（Pythium oligadrum）（单一型），捷克生物制剂股份有限公司生产。（6）3×108CFU·g-1哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（单一型），美国拜沃股份有限公司生产。（7）1×109个孢子·g-1枯草芽孢杆菌·粉红粘帚霉（Gliocladium roseum），（复合型）北京启高生物科技有限公司生产。（8）1×1011个芽孢·g-1枯草芽孢杆菌，又名青叶子（单一型），河北中保绿农作物科技有限公司生产。

1.1.3 .2水剂型生物杀菌剂

（1）5×108CFU·g-1多粘类芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）。（2）1×1010个孢子·g-1解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。（3）3%春雷霉素·5×108个孢子·g-1枯草芽孢杆菌。以上3种菌剂均由武汉科诺生物科技股份有限公司生产。（4）5×109个孢子·mL-1枯草芽孢杆菌，中国农科院植保所研制生产。

1.1.4 仪器设备

电子天平（感量0.1mg）、DHP—9080B电热恒温培养箱、直径90mm的培养皿、三角瓶、移液器、接种刀、镊子、50mL离心管等。

1.2 试验方法

1.2.1 药液配制及浓度设置

1.2.1 .1粉剂型药液

称取0.1g粉剂型杀菌剂放于100mL三角瓶中，加入100mL无菌水溶解，8种粉剂型药剂均用此法配制成100mg·mL-1母液。不同药剂在含药PDA培养基中的浓度设置为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0mg·mL-1共8个梯度。其中母液及各浓度试验药液均现配现用。

1.2.1 .2水剂型药液

用200mL移液器取50mL水剂型杀菌剂于100mL三角瓶中，加入50mL无菌水溶解，4种水剂型药剂均用此法配制成100mL·mL-1母液。不同药剂在含药PDA培养基中的浓度设置为0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1和1.000000mL·mL-1共7个梯度。其中母液及各浓度试验药液均现配现用。

1.2.2 敏感性检测

采用菌丝生长速率法进行检测，将保存的草莓枯萎病菌接种到PDA平皿中，在30℃电热恒温培养箱中培养96h，然后放置在4℃医用恒温箱中保存。试验时在菌落边缘用接种刀切取直径5mm的菌饼，分别转移到按2倍比稀释配制的含药PDA平皿中和空白对照PDA平皿中，在30℃电热恒温箱中培养96h，待对照中菌落长至与平皿直径一样时，采用十字交叉法量取菌落直径（如图1所示）。计算菌落直径均值，按下列公式计算菌丝生长平均抑制率[6]。菌落生长平均抑制率=

图1 1×109CFU·g-1胶冻样类芽孢杆菌·枯草芽孢杆菌抑菌实验Figure 1 Anti-bacterial experiments of Bacillus jelly·Bacillus subtilis（1×109CFU·g-1）

2.1 不同生物杀菌剂对草莓枯萎病菌丝生长的影响

2.1.1 粉剂型药剂对草莓枯萎病菌丝生长的影响

如表1所列可知，稼碧乐、冠蓝、6%春雷霉素、菌益、1×106个孢子·g-1寡雄腐霉菌、3×108CFU·g-1哈茨木霉、1×109个孢子·g-1枯草芽孢杆菌·粉红粘帚霉、青叶子在含药PDA培养基中处理浓度为0.5～100.0mg·mL-1时，对草莓枯萎病菌丝生长的抑制率分别为76.47%～54.12%、82.35%～70.59%、24.12%～11.76%、88.24%～58.82%、52.94%～25.88%、82.35%～10.59%、69.41%～25.88%和76.47%～67.06%。

续上表

2.1.2 水剂型药剂对草莓枯萎病菌丝生长的影响

如表2所列可知，5×108CFU·g-1多粘类芽孢杆菌、1×1010个孢子·g-1解淀粉芽孢杆菌、3%春雷霉素·5×108个孢子·g-1枯草芽孢杆菌、5×109个孢子·mL-1枯草芽孢杆菌在含药PDA培养基上处理浓度为0.000001～1.000000mg·mL-1时，对草莓枯萎病菌丝生长的抑制率分别为64.71%～14.71%、81.18%～52.94%、61.76%～8.82%和76.47～44.12%。结果表明草莓枯萎病菌对不同的水剂杀菌剂敏感性差异较大。

表2 不同浓度水剂型生物杀菌剂对草莓枯萎病菌菌丝生长的抑制效果Table 2 Effect of different bio fungicides on Fusarium wilt of strawberry

2.2 草莓枯萎病对不同粉剂生物杀菌剂敏感性比较

将8种粉剂杀菌剂毒力试验数据进行毒力回归方程分析，其中春雷霉素和寡雄腐霉菌的毒力回归方程显著水平F值＞0.05，因此，这两种杀菌剂建立的模型不合适，所以不做进一步分析。其余6种杀菌剂显著水平F值均＜0.05，其毒力回归曲线是合适的。这6种粉剂杀菌剂与草莓枯萎病菌的抑制率之间是一种不对称的S形曲线关系，将其浓度进行对数转换后作为横坐标，抑制率对应的几率值作为纵坐标，测得回归方程和相关系数R，浓度与抑制率之间表现为一元线性回归关系，通过相关性分析，可以检验线性关系的显著性，分析比较杀菌剂对病菌的毒力。

如表3所示可知，6种供试杀菌剂基本归为3类：青叶子和冠蓝的半最大效应浓度（EC50）均是0.0001mg·mL-1，比其他供试药剂小，说明这2种药剂抑菌效果最好；
稼碧乐和菌益的EC50分别是0.1277和0.0921mg·mL-1，与其他供试药剂相比较小，说明这2种药剂抑菌效果较好；
哈茨木霉和枯草芽孢杆菌·粉红粘帚霉的EC50介于5.0312～6.9675mg·mL-1之间，说明该药剂抑菌效果一般。

表3 草莓枯萎病菌对6种生物杀菌剂的敏感性检测结果Table 3 Results of Fusarium wilt of strawberry to sensibility of 6 bio fungicides

草莓是多年生植物，在同块地里连续多年种植后，会导致土壤中病菌大量积累，加上品种抗病性下降等影响因素，使得草莓枯萎病的发病率逐年加重，因而草莓栽培管理过程中草莓枯萎病防治一直都是重点关注问题。我国北方草莓主要种植在塑料大棚中，枯萎病普遍发生较重，主要使用多菌灵、百菌通（琥铜·锌·乙铝）、代森锰锌、特克多和甲基托布津等杀菌剂进行防治，在秋季盖棚前将植株残体清理后施用药剂处理根部土壤，或在植株发病后灌根[2]。宋志伟等[7]用一种复合微生物制剂对草莓黄萎病的田间防效可达76.9%～84.6%。因此，生物防治是防治草莓枯萎病较适合的方式。

本文采用菌丝生长速率法测定12种生物杀菌剂对草莓枯萎病菌的室内抑菌活性。结果表明：（1）粉剂型杀菌剂的毒力大小顺序为冠蓝＞菌益＞青叶子＞稼碧乐＞1×109个孢子·g-1枯草芽孢杆菌·粉红粘帚霉＞3×108CFU·g-1哈茨木霉＞1×106个孢子·g-1寡雄腐霉菌＞6%春雷霉素；
水剂杀菌剂的毒力大小顺序为1×1010个孢子·g-1解淀粉芽孢杆菌＞3%春雷霉素·5×108个孢子·g-1枯草芽孢杆菌＞5×108CFU·g-1多粘类芽孢杆菌＞5×109个孢子·mL-1枯草芽孢杆菌；
结合粉剂与水剂杀菌剂试验结果，得出12种生物杀菌剂的毒力大小顺序为冠蓝＞青叶子＞菌益＞1×1010个孢子·g-1解淀粉芽孢杆菌＞稼碧乐＞1×109个孢子·g-1枯草芽孢杆菌·粉红粘帚霉＞3×108CFU·g-1哈茨木霉＞3%春雷霉素·5×108个孢子·g-1枯草芽孢杆菌＞5×109个孢子·mL-1枯草芽孢杆菌＞5×108CFU·g-1多粘类芽孢杆菌＞1×106个孢子·g-1寡雄腐霉菌＞6%春雷霉素。（2）微生物杀菌剂中冠蓝比5×109个孢子·mL-1枯草芽孢杆菌的抑菌活性强，说明同种微生物杀菌剂中含孢子越多抑菌活性越强；
试验中冠蓝比6%春雷霉素的抑菌活性更好，表明微生物杀菌剂比抗生素杀菌剂的效果要好；
试验中菌益比5×109个孢子·mL-1枯草芽孢杆菌的抑菌效果更好，则说明复合杀菌剂比单一杀菌剂的抑菌活性更好。近年来，枯草芽孢杆菌在促进作物生长、土壤提质和作物微环境改良、土传病害控制及农业耕地污染治理等方面的作用越来越广泛。水剂杀菌剂中效果最好的是解淀粉芽孢杆菌，与胡亚杰等[8，9]研究结果一致，它的抑制效果明显，且较低浓度时也存在较好的抑制效果。其中，春雷霉素类抗菌素对草莓枯萎病菌的抑制效果最差，木霉类杀菌剂杀菌效果表现不佳，可能与其需要寄生在活体植物上才能表现出较好杀菌效果的特性有关。

综上所述，1×1011个芽孢·g-1枯草芽孢杆菌效果最好，该类药剂具有良好的应用前景；
抗生素类的生物杀菌剂效果最差。本研究仅进行杀菌剂的室内筛选，田间栽培试验还有待开展。另外，还应进一步研究各类药剂的应用技术，从而保证草莓的绿色无公害生产。