2套质谱系统临床微生物鉴定性能评估

刘聪聪， 李佳萍， 周宏伟

（浙江大学医学院附属第二医院检验科，浙江 杭州 310009）

1988年，Tanaka和Hillenkamp将基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）应用于生物大分子分析，开启了MALDI-TOF MS在临床微生物检验领域革命性的新篇章[1]。质谱技术给微生物检验带来的最大变革是对临床微生物的鉴定能力大大提高，原有鉴定方法需要大量的手工操作，且耗时较长，质谱技术能将鉴定时间从几个甚至几十个小时缩短到数分钟。值得一提的是，质谱技术对细菌超强的鉴定能力使得微生物检验跨入一个飞速发展的新时代，其对临床微生物的鉴定准确率超过95%[2-3]。目前，性能得到普遍认可的微生物鉴定质谱仪主要是德国布鲁克公司和法国生物梅里埃公司研发的产品。近年来，国产质谱仪的技术也趋于成熟，上海复星长征医学科学有限公司ATSA MicroIDSys MALDI-TOF MS仪是2018年自韩国引进的新一代质谱系统，目前在我国还缺乏全面的临床微生物鉴定性能评估。本研究对该系统在临床微生物鉴定中的效能进行相对全面的评估，以期为临床微生物实验室提供参考。

1.1 菌株来源

收集2012—2020年浙江大学医学院附属第二医院留存的934株临床分离株（覆盖28个属，70个种或种复合体），包括革兰阴性菌627株（覆盖个18菌属）、革兰阳性菌264株（覆盖9个菌属）、念珠菌43株（20株热带念珠菌、15株白念珠菌、4株季也蒙念珠菌、2株近平滑念珠菌、2株光滑念珠菌），其中包括临床难鉴定的链球菌、奈瑟菌和嗜血杆菌等菌种。另纳入5株临床常用标准菌株，包括大肠埃希菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、流感嗜血杆菌（ATCC 49247）和白念珠菌（ATCC 14053），标准菌株购自中国菌种保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株复苏培养 将所有保存菌株复苏后，分别转种于哥伦比亚血琼脂培养基、巧克力培养基或沙保弱培养基（郑州安图生物工程股份有限公司），35 ℃孵育18～24 h，生长缓慢的菌株适当（48 h）延长孵育时间。

1.2.2 菌种鉴定 采用直接涂抹法，同时使用2套质谱系统[ASTA MicroIDSys MALDI-TOF MS仪及配套CoreDB数据库（简称MicroIDSys系统，上海复星长征医学科学有限公司）和Biotyper MS型系统及配套DB2969数据库（简称Biotyper系统，德国布鲁克·道尔顿公司）]对临床分离株和标准菌株进行菌种鉴定。取少量纯培养菌落直接涂抹于靶板，滴加1 μL基质液（α-氰基-4-羟基肉桂酸）。自然干燥后上机分析。当某1套或2套系统鉴定失败，或2套系统鉴定结果不一致时，采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR）和基因测序方法作为参考方法：扩增rPorB基因并测序，比对不动杆菌属细菌；
扩增hisA基因并测序，比对伯克霍尔德菌属细菌，扩增16S rDNA基因并测序，比对其他细菌；
扩增ITS基因并测序，比对真菌。PCR扩增和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，测序结果与基因文库（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行比对，确定菌种类型。

1.2.3 结果判定 MicroIDSys系统鉴定分值>140为鉴定结果可信；
分值110～140为需要重新鉴定；
分值<110为鉴定失败。Biotyper系统鉴定分值>2.000为鉴定至种水平可信；
分值1.700～1.999为鉴定属水平可信；
分值<1.700为无鉴定结果。

1.3 术语定义

1.3.1 准确鉴定 系统鉴定结果可信，并与参考方法鉴定结果种水平一致。因某些菌种复合体内各种蛋白指纹图谱相似度较高，种鉴定正确和复合体鉴定正确均认定为“准确鉴定”。本研究涉及的菌种复合体包括：（1）鲍曼不动杆菌种复合体[4]；
（2）阴沟肠杆菌种复合体[5]；
（3）洋葱伯克霍尔德复合群[6]；
（4）缓症/口腔链球菌[7]；
（5）蜡样芽孢复合群[8]。

1.3.2 鉴定至属水平 MicroIDSys系统仅提供菌属名称，Biotyper系统重复2次试验鉴定结果均为属水平可信，结果与参考方法结果一致，判定为鉴定至属水平。

1.3.3 鉴定失败 MicroIDSys系统提示“鉴定失败”，Biotyper系统重复2次试验鉴定结果分值均<1.700，判定为鉴定失败。

1.3.4 鉴定错误 系统认为准确鉴定，但与参考方法鉴定结果不一致，判定为鉴定失败。

2.1 2套系统鉴定结果

MicroIDSys系统和Biotyper系统对5株标准菌株和43株念珠菌临床分离株均能准确鉴定。对于934株临床分离株，MicroIDSys系统的鉴定准确率为96.1%（898/934），有11株鉴定失败，有25株鉴定错误（均鉴定为属内其他菌种）；
Biotyper系统的鉴定准确率为98.3%（918/934），有6株被鉴定至属水平，2株溶血色杆菌无鉴定结果，8株鉴定错误。2套系统未准确鉴定结果见表1。

表1 MicroIDSys系统和Biotyper系统未准确鉴定结果

2.2 2套系统革兰阴性菌鉴定结果

对于627株革兰阴性菌，MicroIDSys系统的鉴定准确率为95.1%（596/627）；
有9株鉴定失败，包括3株变栖克雷伯菌、4株溶血嗜血杆菌、1株脑膜炎奈瑟菌、1株产吲哚黄杆菌；
有15株鉴定错误，其中2株阿氏肠杆菌（阴沟肠杆菌复合群）被鉴定为神户肠杆菌，1株潘氏变形杆菌被鉴定为奇异变形杆菌，2株流感嗜血杆菌被鉴定为副流感嗜血杆菌，8株微黄奈瑟菌被鉴定为浅黄奈瑟氏菌，2株溶血色杆菌被鉴定为紫色色杆菌。Biotyper系统的鉴定准确率为98.1%（615/627）；
有4株被鉴定至属水平（2株流感嗜血杆菌和2株微黄奈瑟菌）；
2株溶血色杆菌无鉴定结果；
6株鉴定错误，其中2株溶血嗜血杆菌被鉴定为流感嗜血杆菌，4株微黄奈瑟菌被鉴定为浅黄奈瑟菌。

2.3 2套系统革兰阳性菌鉴定结果

对于264株革兰阳性菌中，MicroIDSys系统的鉴定准确率为95.5%（252/264）；
有2株假白喉棒状杆菌鉴定失败；
有10株鉴定错误，其中2株前庭链球菌被鉴定为唾液链球菌，4株假肺炎链球菌有2株被鉴定为肺炎链球菌、2株被鉴定为缓症链球，1株鼠李糖乳杆菌被鉴定为副甘酪乳杆菌，3株溶血孪生球菌被鉴定为麻疹孪生球菌。Biotyper系统的鉴定准确率98.5%（260/264），有2株被鉴定至属水平（1株假白喉棒状杆菌、1株前庭链球菌）；
2株假肺炎链球菌鉴定错误，被鉴定为肺炎链球菌。

MicroIDSys系统及配套CoreDB数据库（包含2 604种细菌、真菌、分枝杆菌）是从韩国引进的新一代质谱系统。有研究结果显示，MicroIDSys系统对5 322株细菌和酵母菌的鉴定结果与Biotyper系统的一致性很好，种水平符合率为86.1%，属水平符合率为98.4%[9]。另有研究结果显示， MicroIDSys系统对酵母菌的鉴定结果与分子生物学方法的符合率为95.1%（270/284）[10]；
对厌氧菌的鉴定准确率为91.6%（340/370）[11]；
MicroIDSys系统对63株分枝杆菌标准菌株的鉴定准确率为98.4%（62/63），对167株分枝杆菌临床分离株的鉴定准确率为85.6%[12]。JUNG等[13]的研究结果显示，MicroIDSys系统对临床分离菌株的鉴定准确率为96.7%（1 988/2 055），VITEK MS微生物质谱鉴定系统（法国生物梅里埃公司）的鉴定准确率为97.3%（1 999/2 055），提示MicroIDSys系统的检测性能与VITEK MS相当，可用于鉴定细菌和酵母菌临床分离株。赵琳娜等[14]评价了MicroIDSys系统对169种常见微生物的鉴定效能，结果显示，MicroIDSys系统、Autof MS全自动微生物质谱检测系统（郑州安图公司）和Biotyper系统种水平鉴定准确率分别为86.4%（146/169）、91.1%（154/169）和81.7%（138/169），3种质谱系统对常见微生物均有很好的鉴定效能，其中Autof MS在可信水平上的准确鉴定率较高；
但该项研究收集的菌株数量较少，覆盖面较小。本研究收集浙江省某三级甲等综合性医院2012—2020年留存的大量菌株（934株）进行验证，其中包括链球菌属、嗜血杆菌属、奈瑟菌属等临床易混淆的菌株，全面覆盖临床常涉及的微生物，结果显示，MicroIDSys系统种水平鉴定准确率为96.1%，提示MicroIDSys系统在临床微生物鉴定方面具有可靠性。

本研究鉴定失败的细菌共11株，其中6株脑膜炎奈瑟菌和10株产吲哚金黄杆菌各有1株鉴定失败。本研究采用最基本的直接涂抹法，虽节省时间，但和甲酸涂抹法、甲酸萃取法相比，可能会存在涂布薄厚不均或细胞破壁不理想的情况，在实际工作中可以根据菌株特性来选择合适的前处理方法，以提升质谱系统的鉴定准确率。CoreDB数据库中未包含变栖克雷伯菌，可能是本研究3株变栖克雷伯菌均鉴定失败的原因。对于假白喉棒状杆菌和溶血嗜血杆菌，虽然数据库中有相关数据，但本研究鉴定失败，从实验图谱来看，数据峰较差，可能与涂布方法和菌株生长情况有关，后续研究将对这2种细菌进行更多验证，以排除操作不当的影响。

本研究鉴定错误的细菌共25株，均为属内鉴定错误，且大部分是由于MicroIDSys系统数据库缺少相关参考菌株数据所致。潘氏变形杆菌、微黄奈瑟菌、前庭链球菌、假肺炎链球菌、鼠李糖乳杆菌和溶血孪生球菌均都被鉴定为属内其他细菌，提示对于此类细菌，需要纳入更多参考菌株进行数据库建设。本研究部分鉴定错误的细菌，如MicroIDSys系统将阿氏肠杆菌（2株）鉴定为神户肠杆菌，流感嗜血杆菌（2株）鉴定为副流感嗜血杆菌；
Biotyper系统将2株溶血嗜血杆菌鉴定为流感嗜血杆菌，提示对于同一菌属中基因同源性较高的菌株，采用质谱技术鉴定容易混淆。有研究结果显示，VITEK MS微生物质谱鉴定系统将50株溶血嗜血杆菌中的21株鉴定为流感嗜血杆菌[15]。将更多参考菌株纳入数据库中，Biotyper系统对流感嗜血杆菌的鉴定错误率可由13.1%降低至0[16]。遗憾的是，质谱技术用于奈瑟菌的鉴定并不可靠，UNALAN-ALTINTOP等[17]发现，Biotyper系统鉴定的3株奈瑟菌经过16S rRNA测序验证，显示2株鉴定错误，仅1株和测序结果符合，尤其是浅黄奈瑟菌、深黄色奈瑟菌和Neisseria iguanae亲缘关系十分接近[18]，采用质谱技术鉴定更为困难。另外，不能区分假肺炎链球菌和肺炎链球菌也是质谱技术的局限性之一[19]。对于这几类容易混淆的菌种，质谱鉴定结果的判读需要更加慎重，建议用更高质量的图谱更新数据库，以增强识别能力，避免遗漏或错误识别[20]。本研究中，2套系统均未能准确鉴定2株溶血色杆菌。近年来，溶血色杆菌感染人类的报道逐渐增多，该菌对很多抗菌药物天然耐药[21]。在2套系统的数据库中均未包含溶血色杆菌相关信息，Biotyper系统的数据库仅包含紫色色杆菌和铁杉树色杆菌， MicroIDSys系统的数据库仅包含紫色色杆菌。本研究中的2株溶血色杆菌，Biotyper系统无鉴定结果，MicroIDSys系统鉴定为紫色色杆菌，在属水平上有提示意义。

综上所述，MicroIDSys系统对临床常见微生物有较好的鉴定能力，但对一些少见菌种和容易混淆的细菌，仍需通过更新数据库信息来提高鉴定准确率。