纳米银:合成、抗感染与免疫

郭大伟,龚佳豪,粟硕,顾宁

(1.南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095;2.南京大学医学院,江苏 南京 210008)

纳米颗粒是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1～100 nm)的颗粒,其类型分为金属纳米颗粒、非金属纳米颗粒和复合纳米颗粒等,其中,金属纳米颗粒被广泛研究与应用[1]。纳米银是目前研究最多、应用最广泛、商业化程度最高的金属纳米颗粒之一[2-3]。根据形貌、尺寸、电荷和配体等不同,纳米银具有多种特性,表现出广泛的生物学活性,如抗细菌、抗真菌、抗病毒、免疫调节、抗氧化、抗癌和抗炎等[3-6]。目前,纳米银已被应用于疾病治疗、疫苗佐剂、药物递送、伤口敷料、营养保健、生物催化、生物成像和生物传感器等生物医学领域[2,5,7]。

纳米银的制备方法分为物理方法、化学方法和生物方法,3种制备方法各有优劣。然而,物理和化学合成法需使用昂贵设备与有毒化学试剂[8],严重限制了纳米银在兽医领域中的应用。而生物合成法由于成本低、毒性小、方法简单,特别是利用植物及植物提取物能实现大规模合成等优点[9],在兽医领域更具应用前景。在过去20年,纳米银的安全性问题受到了广泛关注,但至今科学界对纳米银的潜在毒性认识仍不明晰[10]。目前,相关毒性研究大多使用柠檬酸或聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)包覆的纳米银开展,研究结论一直存有争议[11],这在一定程度上限制了纳米银在生物医学领域的应用。尽管生物分子包覆剂具有协同生物活性并能降低金属银核的毒性这一观点已被科学界普遍接受,但仍缺乏令人信服的证据[10]。

基于此,本文重点综述了纳米银的合成、抗病原微生物感染及免疫调节方面的研究,分析了纳米银在兽医领域中的应用和潜在毒性,提出了纳米银应用面临的挑战及未来发展方向,为加快纳米银在兽医领域中的转化与临床应用提供新思路。

制备方法的选择是纳米银制备过程中最关键的一步,其对纳米银的尺寸、形貌和表面电荷有极大影响,从而进一步影响纳米银的生物学活性。纳米银的制备方法分为物理合成法、化学合成法和生物合成法。大多数物理合成法通过自上而下的方式,将块体银或较大尺寸银颗粒转化为银纳米粉。相反,化学和生物合成法则均采取自下而上的方式,使银离子前驱体还原为银原子,再经过成核和生长,最终生长成一定尺寸的银纳米颗粒[12]。

1.1 物理合成法

物理合成法是利用机械能、光能、热能等多种形式能量制备纳米银。球磨法、激光烧蚀法、物理气相沉积法和惰性气体冷凝法等是制备纳米银的常用物理方法[13]。球磨法是最常用的机械物理方法,通过将较粗大的银粉置于高能磨机中,球磨成纳米银[14]。球磨法可制备粒径均匀且小于100 nm的纳米银粉,但存在产物易污染、机器清洗繁琐等缺点[15]。激光烧蚀法是另一种制备纳米银的常用物理合成法,是利用聚焦脉冲激光束从固体表面烧蚀材料[16]。该方法传热小、环境毒性小,不足之处是能耗大且需要昂贵的专用设备[17]。总之,物理合成法的复杂性更适合制备银基纳米复合材料,而不是单纯的纳米银颗粒。

1.2 化学合成法

化学合成法是利用化学物质作为还原剂和稳定剂制备纳米银的方法,常用的有多元醇法、溶剂热法、沉淀法和电化学法等[18]。多元醇法是一种将银离子前驱体与乙二醇溶液混合后加热回流以制备纳米银的方法[19],可控制银纳米颗粒的成核、生长和团聚,但该法存在极性多元醇对非极性金属表面的稳定作用不强的缺陷[20]。溶剂热法是另一种常用制备方法,在高蒸汽压、高温水浴条件下生成银纳米晶[21],其能精确控制纳米银的尺寸、形貌和结晶度,但存在高压釜价格昂贵、安全性低以及无法跟踪反应进程的问题[22]。总之,制备方法的复杂性与纳米颗粒的不均匀性是限制化学法大规模生产纳米银并走向应用的主要因素。

1.3 生物合成法

由于物理和化学合成法需要昂贵设备和有毒化学物质,且反应能耗大,因此科学家倾向于利用生物(植物或微生物)方法制备纳米银的生物合成法[8]。该法是指从植物、藻类、细菌和真菌等生物体中提取生物分子(多糖、多酚、羧酸、生物碱和萜类化合物等)作为还原剂、包覆剂与稳定剂,还原银离子前驱体以合成纳米银[23]。另外,细胞内合成方法也属于生物合成法,目前仍处于研究探索阶段[24-26]。

生物合成法由于反应过程无毒、可持续性强,因此相对于物理和化学合成法具有显著优势[27-28]。此外,生物合成法也符合绿色化学合成理念,反应是一个环境友好、生物相容的过程,通常在温和pH值(4～9)、标准大气压条件下进行;另外也具有成本效益[29-31]。

尽管利用细菌和真菌体内合成纳米银耗能小,但是存在难以大规模合成、培养基易污染、纳米颗粒易团聚等问题[32]。而植物及其提取物作为天然、潜在的还原剂和稳定剂(如表1所示),其原材料遍布世界各地[33]。利用植物及其提取物制备纳米银,成本低、制备方法简单、能大规模合成,但仍需解决纳米颗粒易团聚和稳定性较低的挑战[9]。

表1 不同植物(植物提取物)中的生物活性成分及其合成的纳米银粒径Table 1 The bioactive components in different plants(plants extracts)and the size of synthesized silver nanoparticles

2.1 抗菌活性及机制

大量研究表明,纳米银对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抗菌活性,且对革兰氏阴性菌的抑制作用更强。本课题组Tang等[6]和Guo等[36]分别利用没食子酸和香菇多糖为还原剂合成纳米银,发现其对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌均有抗菌活性,且对大肠杆菌、铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)小于金黄色葡萄球菌和粪肠球菌,推测是由于革兰氏阴性菌细胞壁含带负电荷的脂多糖分子,对纳米银释放的银离子具有亲和性,导致革兰氏阴性菌对银离子的吸收增加并加剧细菌的损伤。

纳米银的抗菌活性受表面电荷、颗粒尺寸、晶体结构、形状等参数影响。纳米银的抗菌机制至今尚未完全清楚。目前关于纳米银的抗菌机制如图1所示。主要包括:1)破坏细菌细胞膜,使其丧失渗透性[43];2)诱导细菌DNA的结构发生变化,抑制其DNA的复制[5];3)诱导活性氧(ROS)的产生,导致细菌呼吸功能障碍和死亡[44];4)缓慢、持续地释放银离子[6]。

图1 纳米银的抗细菌机制(改编自Majeed等[45])Fig.1 The mechanisms of silver nanoparticles against bacteria(modified from Majeed et al[45])

除强大的抗细菌活性外,纳米银也具有良好的抗真菌活性,Tang等[6]报道生物合成的纳米银能有效抑制白色念珠菌的增殖。纳米银抗真菌的作用机制与抗细菌的相似。

2.2 抗病毒活性及机制

纳米银对动物病毒如新型冠状病毒[46]、人类免疫缺陷病毒(HIV)[47-48]、流感病毒[49]、肝炎病毒[50-51]、非洲猪瘟病毒[52]、猪流行性腹泻病毒与猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒[53]和植物病毒如大豆花叶病毒[54]等具有高效的抗病毒活性,且不易产生耐药性。纳米银能靶向病毒生命周期的不同阶段(如图2所示),抑制病毒在宿主细胞内的增殖。具体作用机制如下。

图2 纳米银的抗病毒机制(改编自Ghosh等[60])Fig.2 Antiviral mechanisms of silver nanoparticles(modified from Ghosh et al[60])

2.2.1 阻断病毒进入细胞纳米银能阻断病毒与细胞受体结合,进而避免病毒通过直接融合或受体介导的内吞作用进入细胞。Elechiguerra等[47]首次提出HIV壳膜蛋白结构(gp120)可能是纳米银抗HIV的潜在分子靶标。Lara等[48]研究证实了上述推测,发现纳米银能使gp120的2个二硫键变性,阻断gp120与CD4+T细胞受体结合,防止合胞体形成,表明纳米银能阻断HIV进入CD4+T细胞,此外,他们还发现纳米银对几株耐药HIV-1也具有抗病毒效果。

2.2.2 抑制病毒DNA复制带负电荷的纳米银能与DNA相互作用,尤其是富含GC碱基的DNA[55]。Shrivas等[56]发现纳米银对二嗪农(含嘧啶氮)具有极高的亲和性,进而推断嘧啶的高电荷密度能促进其与纳米银的非共价相互作用。随后,Lu等[57]通过试验证实纳米银能抑制病毒复制,其通过研究纳米银对感染乙肝病毒(HBV)的HepAD38人肝癌细胞的作用,发现纳米银能与HBV双链DNA结合,抑制前基因组RNA转录,导致松弛环状DNA逆转录受阻,继而抑制子代病毒粒子的形成。

2.2.3 干扰病毒组装干扰病毒基因组的组装也是抗病毒治疗的目标之一,通过这种方式能阻止子代病毒粒子的形成。Whiteley等[58]和Tsai等[59]研究发现纳米银能与HIV-1蛋白酶结合并抑制其活性,干扰HIV基因组的组装。Shady等[50]利用红海海绵生物合成纳米银,发现其能靶向丙型肝炎病毒NS3活性位点,灭活NS3解旋酶和蛋白酶,阻断病毒基因组的组装。

2.2.4 调节宿主免疫反应在病毒感染细胞中,纳米银除能抑制感染细胞凋亡与自噬外,还能调节机体免疫反应[61-62]。Villeret等[62]证实纳米银通过IL-8依赖的中性粒细胞募集和下调抗病毒干扰素途径以增强免疫。Morris等[63]通过呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠模型,阐明了纳米银抗RSV的机制。他们发现小鼠支气管肺泡灌洗液中的促炎细胞因子与趋化因子如IL-6、IL-10、TNF-α、趋化因子C-C基序配体(CCL2、CCL5)和I型IFN等的表达量下调,而趋化因子C-X-C基序配体(CXCL1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等参与中性粒细胞募集的细胞因子表达量上调,表明纳米银通过激活中性粒细胞,发挥抗病毒活性。而中性粒细胞的激活能募集单核细胞和释放中性粒细胞胞外陷阱,进而增强宿主天然免疫,并防止继发性细菌感染。

纳米银可诱导中性粒细胞和巨噬细胞产生ROS,如过氧化氢和次氯酸钠,这通常是宿主抵御病原微生物的首要途径[64]。Gonzlez-Ballesteros等[65]发现生物合成纳米银能诱导ROS产生,释放细胞因子和激活补体,表现出免疫调节活性。此外,纳米银还能与活性氮特别是一氧化氮相互作用,增强宿主抵御病原微生物的能力。Shaikh等[66]研究强调纳米银能增强活性氮的杀菌作用。

纳米银属于颗粒抗原,较大的比表面积等特性使其具有较强的免疫原性。Li等[67]发现纳米银能升高兔血清IgG抗体水平,表明纳米银具有良好的免疫原性;他们还发现纳米银的抗原性具有高度的尺寸依赖性。纳米银的免疫原性可能与其在给药部位引起的促炎反应或细胞死亡后释放的损伤相关分子模式相关,间接激活先天免疫细胞,释放促炎细胞因子[68]。Xu等[69]通过小鼠腹腔或皮下免疫纳米银和模型抗原鸡卵白蛋白或牛血清白蛋白,发现纳米银能显著提高特异性IgG和IgE抗体水平,诱导Th2偏向促炎免疫反应。研究机制表明纳米银能募集和激活局部白细胞和巨噬细胞。

近些年,科研者还通过将纳米银功能化,使其表现出独特的免疫调节活性,如靶向抗原递呈细胞或激活抗病毒天然免疫反应等。Yang等[70]报道Heparosan细菌荚膜多糖包覆的纳米银能被固有免疫细胞高效摄取。Krzyzowska等[71]发现乳铁蛋白功能化的纳米银能诱导早期抗单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的天然免疫反应,表现为纳米银增加小鼠阴道组织中CD8+/颗粒酶B+T细胞、NK细胞和DC细胞的数量和细胞因子IFN-γ、IL-1β以及趋化因子CXCL9、CXCL10的表达水平。

基于上述纳米银的免疫调节活性,科研人员越来越多地将纳米银应用于免疫佐剂领域。Kuang等[7]报道纳米银能作为联合PD-1单克隆抗体免疫治疗黑色素瘤的佐剂。他们发现蔗糖包覆的小尺寸纳米银能活化细胞毒性T淋巴细胞并促进其在肿瘤微环境的浸润,此外,还能上调肿瘤细胞膜表面的PD-L1受体表达。总之,纳米银联合PD-1单克隆抗体表现出良好的局部抗肿瘤活性和轻微的全身免疫毒性。

尽管纳米银有潜力作为疫苗佐剂,然而目前关于纳米银作为疫苗佐剂的研究依旧很少,其作用机制目前尚未完全清楚。Asgary等[72-73]发现纳米银能作为狂犬病疫苗佐剂,产生更高水平的抗病毒中和抗体,提高疫苗免疫效力。另有研究显示,高表面能的纳米银能促使蛋白质抗原吸附到纳米银表面,形成蛋白冠,提高蛋白质抗原在体内的稳定性与半衰期,促进蛋白质抗原的摄取与递呈[74-75]。Sanchez-Guzman等[76]发现纳米银能够和模型抗原钥孔戚血蓝蛋白发生直接物理结合,腹腔免疫纳米银能显著增加分泌性浆细胞数量与血清特异性IgG抗体水平。他们还发现,纳米银诱发免疫应答的类型与给药部位有关,肺内免疫纳米银可诱发强烈的黏膜免疫应答。相较于PolyIC和AdVax佐剂,纳米银能作为灭活流感疫苗的黏膜佐剂,免疫后能降低感染小鼠的病毒载量并预防过度的肺部炎症,机制研究表明纳米银能促进支气管相关淋巴组织新生,增加分泌特异性IgA的浆细胞数量及其抗体水平。

鉴于纳米银强大的抗病原微生物作用与免疫调节活性,其在畜牧兽医领域中有极其广阔的应用前景,如用作病原体感染防治药物、畜禽养殖消毒剂和免疫增强剂等[77]。在水产养殖中,纳米银被用于改善水质、控制水生病原体和促进水产动物生长[78-79]。Thanigaivel等[80]利用海藻提取物生物合成纳米银,证实纳米银对危害水产养殖的哈氏弧菌具有体内外抗菌活性。他们还将纳米银包封于微囊中并与虾饲料混合,给予口服治疗实验致病性罗氏沼虾,结果表明纳米银的微囊化能有效提高罗氏沼虾对哈氏弧菌的抗病力。Elgendy等[81]发现纳米银对耐药维氏气单胞菌也具有体内外抗菌作用。纳米银对危害鱼类养殖的纤毛虫也具有杀灭作用。Fuentes-Valencia等[82]发现纳米银能通过减小纤毛数量、破坏细胞膜等方式杀灭四膜虫,并且不会对鱼类造成任何组织病理损伤或肠道微生物的变化。纳米银还有潜力应用于宠物皮肤感染治疗。Artunduaga-Bonilla等[83]将绿色合成的纳米银与壳聚糖复合成银纳米材料,发现银纳米材料能有效治疗小鼠皮肤念珠菌病,并促进皮肤组织的愈合。畜禽养殖场消毒一直是最有效和经济可行的防控畜禽传染病的方法,纳米银因其高效灭活致病病原体的特性,显示出替代现有传统化学消毒剂的潜力。在实验室条件下和户外兽医实践中已证明纳米银作为畜禽养殖场消毒剂的效果显著[84]。在畜禽感染性疫病防治方面,纳米银也发挥重要作用。Valente等[85]报道生物合成的纳米银能有效治疗实验性脓毒症,纳米银还能治疗肉鸡的产气荚膜梭菌引起的相关坏死性肠炎和大肠杆菌感染引起的结肠败血症等[86-87]。

纳米银在生物医学应用中表现出的潜在毒性也正逐渐被研究人员所关注。纳米银能通过吸入、摄食、皮肤接触和注射给药等途径进入人类和动物体内,分布于呼吸、消化、神经、免疫、生殖和泌尿等系统。纳米银的潜在毒性取决于摄入途径和粒子特性,如大小、形状和浓度等[88]。小尺寸纳米银更容易跨越血脑、血睾屏障等生物屏障,也更容易与生物系统中的蛋白质、核酸和碳水化合物相互作用,改变其表面性质,而表面性质变化在纳米银与细胞表面受体的相互作用中起重要作用,促进纳米银以内吞方式被细胞摄取。细胞摄取纳米银可诱导ROS的产生,导致细胞死亡[89]。此外,纳米银能透过细胞膜,产生更高水平的细胞内Ag+,引起细胞毒性和基因毒性。Wang等[90]试验表明细胞毒性由纳米银的化学转化引起,比如Ag0转化为Ag+、Ag-O-和Ag-S-等,导致细胞生理生化的潜在变化。纳米银的细胞毒性作用主要表现在氧化应激、DNA损伤和细胞因子产生的调节等方面。基因毒性方面,纳米银产生的ROS通过减少ATP生成,导致DNA损伤,这也与线粒体损伤相关,纳米银能损害能量依赖的DNA修复机制[91]。另有报道称纳米银自身或释放的Ag+均能直接损伤DNA[92-93],进而引发致畸和致突变等。Myung等[94]发现斑马鱼胚胎经240 nmol·L-1市售纳米银处理72 h后,相较于对照组,致畸率(15%)与死亡率(11%)显著升高。Khan等[95]也观察到生物合成的纳米银(100 μg·mL-1)能引起斑马鱼胚胎畸形,具体表现为卵黄、心脏与尾部畸形。急性毒性研究表明,纳米银对斑马鱼胚胎的LC50为22 ng·mL-1,而对成年斑马鱼的LC50为3.5 μg·mL-1[96]。Kermanizadeh等[97]和Albrahim等[98]分别开展了相同剂量(每只100 μg)纳米银在3种不同暴露途径(气管滴注、口服与静脉注射)下对小鼠的急性毒性研究,揭示出纳米银的生物蓄积与毒性在静脉注射途径中最为显著,在肝脏、脾脏和肾脏中的银含量最高,引发严重肝脏炎症;而慢性毒性试验则进一步阐明纳米银的靶器官为肝脏,其通过扰乱肝功能,诱导氧化应激和促进细胞凋亡进而引起肝脏毒性。

纳米银在兽医领域具有巨大的开发与应用潜力,尤其是生物合成的纳米银由于经济环保、生物相容性好而被寄予厚望,研究人员将生物合成的纳米银作为潜在的畜禽抗感染防治药物和疫苗佐剂或免疫增强剂的热情日益增长,并不断尝试将其应用于畜禽感染性疾病的防治之中。然而迄今为止,关于纳米银对人体自身、动物和生态的潜在毒性及其他负面影响的研究尚不够深入[10]。因此,未来迫切需要深入研究纳米银与人类、动物和生态环境之间的相互作用,以及其对局部和全球生态系统的影响[23]。同时也要更全面深入地探索纳米银的生物相容性和潜在毒性,这有助于开发更安全、生物相容性更好的纳米银,促进纳米银更有效地转化并应用于兽医临床。