超声处理对大豆蛋白水解副产物中肽提取的影响

张 伟，阮定峰，朱秀芳，于玉霞

(1.荣海生物科技有限公司，江苏 镇江 212000；
2.诺利如一(安阳)生物科技有限公司，河南 安阳 455000)

大豆肽是大豆蛋白经蛋白酶水解或微生物发酵等方法所制得的分子量集中在1 000 u以下并具有某些生理功能的混合低聚肽。它既具有大豆蛋白质的营养学特性，又具有小分子肽所特有的物化特性，极易溶于水，在肠道中的吸收速度是普通蛋白质的20倍、氨基酸的3倍[1]，适合蛋白质消化吸收不佳的人群食用，如中老年人、手术后恢复期病人、肿瘤及放化疗病人、胃肠功能不佳者等。

大豆蛋白质的氨基酸组成与牛奶蛋白质相近，是植物性的完全蛋白质，在营养价值上可与动物蛋白等同，在基因结构上也与人体最为接近，是最具营养的植物蛋白质。大豆肽富含 22 种氨基酸，其中包含 9 种人体不能合成的必需氨基酸，并且 FAO/WHO(1985)人类试验结果表明，大豆蛋白质中必需氨基酸的组成较适合人体需要。

在肽的加工过程中其水解副产物主要为未水解的蛋白质和未分离的肽，经检测，其蛋白质含量和肽含量分别达到80%以上和20%以上(以干基计)。目前，对水解副产物大都作为饲料配料进行处理，这大大降低了其附加值。近年来，超声波技术在蛋白酶解领域有较好的应用前景，能够提高蛋白质转化率、缩短蛋白质的酶解时间[2-6]。超声波在介质中传播时，会产生热效应、机械效应和空化效应，引起介质的一些特性变化[7]。因此，在促进活性成分的提取[8]、辅助酶解[9]和促进蛋白乳化[10]等方面起到显著的效果，其中最为显著的是在超声辅助酶解方面，可以缩短酶解时间、提高酶解效率、增加产物得率[11]。目前对超声辅助处理蛋白水解副产物提取残留肽的研究较少。

本研究以蛋白水解副产物为原料(其来源于大豆分离蛋白酶解后经超滤膜过滤分离出的副产物)，利用超声处理的机械效应和空化效应使肽释放并提取。在单因素试验基础上，通过正交试验对超声处理工艺进行优化，然后对处理后的蛋白质水解副产物离心分离提取上清液，并进行肽含量分析、蛋白含量分析以及分子量分布测定。该研究提高了肽提取率，还使其分子量分布更小，为超声在大豆肽的实际生产及其在食品领域的开发与应用提供参考。

1.1 材料与仪器

蛋白水解副产物(水分97.3%，肽含量(以干基计)≥20%,为大豆分离蛋白酶解后经超滤膜过滤分离出的副产物)：诺利如一(安阳)生物科技有限公司；
胰岛素、杆菌肽、细胞血素C、人血管紧张素：Sigma公司；
乙腈：色谱纯；
其他试剂均为分析纯。

KS-180AL超声清洗机：深圳市洁康洗净电器有限公司；
Kjeltec 8400凯氏定氮仪：美国福斯公司；
S433D全氨基酸自动分析仪：德国赛卡姆Sykam 公司；
ME104E万分之一电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；
KDC-40 台式离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；
Thermo U-3000 高效液相色谱仪：赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1工艺流程

蛋白水解副产物→超声处理→离心→含肽上清液

1.2.2单因素试验

蛋白水解副产物(水分97.3%，肽含量(以干基计)≥20%)作为原料，加水/不加水稀释，以超声处理温度、时间、功率及料液比为因素条件进行试验。

(1)在超声处理时间、功率、料液比一定的条件下，超声处理温度分别设定为30、40、50、60、70℃进行试验。

(2)在超声处理温度、功率、料液比一定的条件下，超声处理时间分别设定为10、20、30、40、50 min进行试验。

(3)在超声处理温度、功率、时间一定的条件下，料液比分别设定为1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1(g/ml)进行试验。

(4)在超声处理温度、时间、料液比一定的条件下，超声处理功率分别设定为400、550、700、850、1 000 W进行试验。

1.2.3正交实验

根据单因素试验结果，选取超声处理温度、时间、功率及料液比3个水平进行L9(34)正交试验，得到超声处理最优工艺。

1.2.4肽含量测定

参照国标GB/T 22492—2008大豆肽粉中肽含量检测方法。

1.2.5肽提取率的测定

1.2.6分子量的测定

采用高效凝胶过滤色谱法测定。

色谱柱：TSKgelG2000SWXL 300 mm×7.8 mm(内径)；
流动相：乙腈+水=20+80；
检测波长：220 nm；
流速：0.5 ml/min；
检测时间：30 min；
进样体积：20 μl；
柱温：25℃(室温)。

标准品的制备：4种分别用流动相配制成质量浓度1 mg/ml的分子量标准品，各取2 ml，定容为10 ml。超声脱气10 min，用孔径0.2～0.5 μm有机相膜过滤后进样，得到标准品的色谱图。以相对分子质量的对数对保留时间作图或作线性回归得到相对分子质量校正曲线及其方程。

样品的制备：准确称量样品10 mg于10 ml容量瓶中，加入少许流动相，超声10 min，用孔径0.2～0.5 μm有机相膜过滤，进样分析。

相对分子质量分布的计算：将样品进样分析后，用GPC数据处理软件，将样品的色谱数据代入校正曲线进行计算，即可得到样品的相对分子质量及其分布范围。用峰面积归一化法计算得到不同肽段相对分子质量的分布情况，公式如下：

计算结果保留小数点后一位。

2.1 单因素试验

2.1.1超声处理温度对蛋白水解副产物中肽提取率和肽含量的影响

在不稀释情况下固定超声时间为30 min、功率为1 000 W，研究30、40、50、60、70℃温度下对蛋白水解副产物中肽提取率和肽含量的影响，结果见图1。

图1 超声处理温度对肽提取率及肽含量的影响

根据图1得出，超声温度越高，肽提取率先增加后趋于稳定，超声温度为60℃时肽提取率最高，达到28.72%；
超声温度为70℃时，提取物肽含量达到最大，为86.56%。温度主要影响料液的黏度和超声的空化作用。随着温度的升高，料液的黏度逐渐下降，这有利于超声波的传导，当升高到一定值时，超声空化作用达到饱和，继续升温，效果不再提高，反而会造成不必要的能耗。因此综合考虑肽提取率和上清液肽含量，选择60℃为理想超声温度。

2.1.2超声处理时间对蛋白水解副产物中肽提取率和分子量分布的影响

在不稀释的情况下固定超声温度60℃、功率1 000 W，研究10、20、30、40、50 min处理时间下对蛋白水解副产物中肽提取率和肽含量的影响，结果见图2。

图2 超声处理时间对肽提取率及肽含量的影响

根据图2得出，超声处理时间越长，上清液肽的提取率总体呈现越来越高的趋势，在处理30 min时达到最大值28.72%，随着时间的延长，肽提取率不再明显提高，且上清液中肽含量随超声处理时间的延长变化不大；
这主要是因为超声处理30 min后肽在空化作用下被充分释放分离，延长超声处理时间反而会产生不利于蛋白溶液溶解的聚集使肽提取率下降，所以超声处理时间选择30 min较为合适。

2.1.3料液比对蛋白水解副产物中肽提取率和分子量分布的影响

固定超声温度60℃、功率1000 W、超声处理时间30 min，研究料液比为1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1(g/ml)时对蛋白水解副产物中肽提取率和肽含量的影响，结果见图3。

图3 料液比对肽提取率及肽含量的影响

根据图3得出，在料液比为1∶0.4(g/ml)时，无论是上清液肽提取率还是上清液肽含量均达最大值，分别为37.59%和88.41%。料液比高时，物料黏度大，超声波的传递受阻，影响空化作用；
当料液比达到1∶0.4(g/ml)时，物料能够充分的受到空化作用，使肽提取率最高；
料液比继续减小，蛋白物料分子受空间位阻的作用，肽提取率不再增加。所以料液比选择1∶0.4(g/ml)较为合适。

2.1.4超声功率对蛋白水解副产物中肽提取率和分子量分布的影响

固定料液比为1∶0.4(g/ml)、超声温度60℃、超声处理时间30 min，研究400、550、700、850、1 000 W超声功率下对蛋白水解副产物中肽提取率和肽含量的影响，结果见图4。

图4 超声功率对肽提取率及肽含量的影响

根据图4得出，超声功率逐渐增加，上清液肽的提取率和肽含量呈现增高趋势，这表明超声功率的适当增加可以提升溶液的能量密度，产生更强烈的空化效应，从而使蛋白质的发生造成不同程度的改变，溶解性提升的同时使包裹在蛋白质内部的肽段能够释放出来。而当超声功率超过850 W后，上清液肽的提取率和肽含量出现明显下降，这可能是由于过高局部热量的产生使蛋白质的构象朝着不利于溶解的方向变化，进而导致肽的析出分离困难。因此，初步选定最佳超声功率为 850 W。

2.2 正交试验

在单因素实验的基础上，以超声处理温度、时间、功率和料液比为考察因素，上清液肽的提取率和肽含量(以干基计)为考察指标，设计四因素三水平正交实验，因素水平见表1，正交实验结果及分析见表2。

表1 因素水平

表2 正交实验结果及分析

由表2可以看出，影响上清液肽提取率的因素主次顺序为料液比(C)、超声时间(B)、超声温度(A)、超声功率(D)；
影响上清液蛋白肽含量的因素主次顺序均为超声功率(D)、料液比(C)、超声温度(A)、超声时间(B)。考虑到生产成本，在保证肽含量不低于86%的基础上选择肽提取率最高的条件，故最佳工艺组合为A1B1C1D1，在正交表中为第1组实验，达到最高的肽提取率，即超声温度55℃，进超声时间25 min，料液比1∶0.4(g/ml)，超声功率700 W。

2.3 验证性试验

在上述最佳工艺条件下，通过3次平行试验进行验证，上清液肽提取率和肽含量(以干基计)分别为41.83%和86.13%。最佳工艺条件下与未超声处理得到的上清液肽提取率和相对分子质量分布比例对照结果见表3。

由表3可以看出，未经超声处理蛋白水解副产物的上清液肽提取率为15.12%，经最优工艺超声处理后蛋白水解副产物的上清液肽提取率提高到41.83%，说明超声处理能够显著提高蛋白水解副产物中肽的进一步提取。同时相对分子质量在1 000 u以下的小分子肽比例从83.77%提高到90.81%，是由于超声的空化作用对肽段产生分子结构的改变。

表3 上清液肽提取率和相对分子质量分布比例

超声波处理能显著提高蛋白水解副产物的上清液肽提取率和肽含量，最佳的工艺条件为：超声温度55℃，超声时间25 min，料液比1∶0.4(g/ml)，超声功率700 W。在最佳工艺条件下，蛋白水解副产物的上清液肽提取率和肽含量(以干基计)分别达到41.83%和86.13%。与未经超声波处理相比，超声处理有利于蛋白水解副产物中肽的进一步提取，避免了价值高的小分子肽的损失，提高了其附加值。