复方紫草阴道用微乳-原位凝胶的制备与评价*

赵玉娜，刘青，何艳萍，高婷，陈晶

(宁夏医科大学总医院制剂中心，银川 750004)

复方紫草油为我院自制制剂，处方由紫草、白芷、当归、冰片等药材组成，具有清热凉血、解毒止痛等功效[1]，除可抗菌消炎外还有生肌和促进上皮生长功能，其止痛效果好，创面愈合快，用于妇科阴道炎、宫颈糜烂等疾病治愈率高，疗效确切，阴道不适症状可得到明显改善，且不影响宫颈弹性，具有良好的临床应用前景[2]。

临床使用复方紫草油时，将油制剂制备成含药纱条，将纱条填入患者阴道，使其紧贴宫颈糜烂面，30 min后取出或留出尾端于阴道口外，嘱患者睡前取出。该药存在患者自主给药困难、使用时有异物感、给药次数频繁、患者顺应性差等缺点，因此有必要将其制备成阴道黏膜给药制剂。温度敏感型原位凝胶是一类以溶液给药、在生理条件下转化为非化学交联半固体的制剂，其基质常选用泊洛沙姆407(Poloxamer 407，P407)和泊洛沙姆188(Poloxamer 188，P188)[3]，其在低温时呈低黏度流体状态，置入阴道后，在体温条件下与多褶皱的阴道黏膜组织紧密贴合，并迅速转变为半固体凝胶，可增强药物生物粘附性、延长药物滞留时间并提高生物利用度[4-5]。笔者在本实验将复方紫草油制备成温度敏感型微乳-原位凝胶，并对其性状、粒径、流变学性质、体外释放度等进行研究，以期为该制剂用药研究提供理论依据。

1.1仪器 高效液相色谱仪(Waters 2489紫外检测器，1525泵)；
MS105DU 型分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司，感量：0.01 mg)；
THZ-D恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司)；
TGL-16C台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；
79-1磁力加热搅拌器(江苏江阴科研器械厂)；
ST2100 pH计(常州奥豪斯仪器有限公司)；
Malvern Nano ZS-90型粒度电位仪(英国马尔文仪器有限公司)；
H-7650透射电子显微镜(日本日立)。

1.2试剂 左旋紫草素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110769-200506，含量：99.8%)；
复方紫草干浸膏(本实验室自制，左旋紫草素含量1.72 mg·g-1)；
P407(批号：GND11321B) 、P188(批号：GND10221B)、聚氧乙烯-35-蓖麻油(EL-35，批号：95284497V0)、肉豆蔻酸异丙酯(IPM，批号：00018999798)均来自德国BASF公司；
丙三醇(批号：20190401)、磷酸(批号：20170801)来自天津市大茂化学试剂厂；
甲醇(美国Fisher chemical公司，色谱纯，批号：190291)。

2.1复方紫草微乳处方的筛选与确定

2.1.1微乳油相、乳化剂和助乳化剂的筛选 将足量干浸膏分别加入含有2 mL不同溶媒的具塞试管，置涡旋振荡器涡旋10 min，充分混匀，置(37±1) ℃恒温振荡器振荡72 h至达到溶解平衡；
将混合物5000 r·min-1离心15 min，孔径0.45 μm微孔滤膜过滤；
取续滤液，采用高效液相色谱(HPLC)法检测指标成分左旋紫草素峰面积，计算其在不同组分中的溶解度，筛选增溶效果较好的油相、乳化剂和助乳化剂[5-6]。结果见表1。

表1 左旋紫草素在不同组分中的溶解度测定结果

结果表明，左旋紫草素在油相IPM、乳化剂EL-35和助乳化剂丙三醇中的溶解度较大，故本实验选择IPM、EL-35和丙三醇分别作为油相、乳化剂和助乳化剂，通过绘制伪三元相图确定微乳各相比例。

2.1.2微乳各相比例的确定[7-8]将乳化剂与助乳化剂分别以质量比(即Km值)3：1，2：1，1：1 混合均匀，制成混合溶液。将混合溶液与油相按质量比9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，4：6，3：7，2：8，1：9的比例混匀，在持续磁力搅拌条件下，缓慢滴加超纯水，直至体系平衡形成澄清透明微乳，记录此时加水量。计算临界点油相、混合表面活性剂及水相在微乳体系中的质量分数，借助Origin 8.5版软件绘制微乳伪三元相图，并选择适宜Km值。复方紫草微乳伪三元相图见图1。

图1 不同乳化剂和助乳化剂比例微乳的伪三元相图

当Km值为3：1时，微乳区域面积较大，从相图中选择微乳的组成为油相(12.5%，W/W)，乳化剂系统(37.5%，W/W)和纯化水(50%，W/W)，并确定Km值为3：1。

2.1.3复方紫草微乳的制备 称取复方紫草干浸膏2.0 g，置4.0 g IPM中超声加速溶解，取混合乳化剂(EL-35 9.0 g和丙三醇3.0 g)加入上述油相，室温下磁力搅拌混合均匀，缓慢滴加超纯水至100.0 g，使成澄清透明液体，制成微乳。依此重复制备微乳液3批[9]。

2.2复方紫草微乳-原位凝胶的制备[10]P407溶液在达到临界胶束浓度和温度后，亲水性聚氧乙烯(PEO)段和疏水性聚氧丙烯(PPO)段相互作用，紧密堆砌缠绕形成半固体凝胶，在P407中加入适量P188，可调节PEO/PPO比例，达到理想胶凝温度[11]，使凝胶液能够在30 ℃内保持液态，且经模拟阴道液[12-13]稀释后的凝胶在约34 ℃时，形成半固体态凝胶。

采用冷溶法[14]制备复方紫草阴道用微乳-原位凝胶。取制备好的微乳，加入处方量P407和P188，充分搅拌后置4 ℃冰箱溶胀24 h，取出该微乳-原位凝胶液，缓慢搅拌使分散均匀，阴道用制剂pH值应为4.0～5.5[15]，故使用稀盐酸调节凝胶液pH值至该范围，即得复方紫草微乳-原位凝胶液。

健康女性阴道内温度37.2～37.8 ℃，理想温敏凝胶应在尚未达到体温条件下即迅速成胶[16]，故期望本制剂胶凝温度约为34 ℃。通过多次预实验并结合文献[7，9]可知，微乳中含有表面活性剂和油相，会影响分子物理聚集和缠结，达到理想胶凝温度时，凝胶基质浓度显著降低。当P407和P188浓度分别为100和20 mg·mL-1时，制备的微乳凝胶经模拟阴道液稀释后，胶凝温度为34.5 ℃。推断复方紫草微乳-原位凝胶具有温度敏感性，可在阴道环境下胶凝为半固体凝胶。

2.3复方紫草微乳-原位凝胶中左旋紫草素含量测定方法的建立

2.3.1色谱条件 色谱柱：Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；
流动相：甲醇-0.1%磷酸(85：15)；
检测波长：516 nm；
流速：1 mL·min-1；
柱温：30 ℃；
进样量：20 μL。

2.3.2供试品及对照品溶液的制备与测定 取复方紫草微乳-原位凝胶，精密称取5.0 g于25 mL量瓶，加适量甲醇，超声处理10 min使破乳，冷却至室温，甲醇定容，摇匀，取溶液适量至离心管，5000 r·min-1离心15 min后取上清液，经孔径0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。以左旋紫草素为对照品，精密称取对照品10 mg于100 mL量瓶，加适量甲醇使药物溶解并定容，摇匀，作为储备液。精密移取1 mL于10 mL量瓶，加甲醇稀释并定容，作为对照品溶液。按“2.3.1”项色谱条件进行测定，记录峰面积，以外标法计算含量。

2.3.3方法学验证 专属性考察：分别取空白凝胶溶液、对照品溶液和供试品溶液按“2.3.1”项色谱条件进样，记录色谱图，空白凝胶、左旋紫草素对照品溶液、复方紫草微乳-原位凝胶的色谱图见图2。结果表明，左旋紫草素与杂质峰分离良好，杂质峰对测定结果无干扰。该方法准确可靠，适用于药物含量测定及释放行为的考察。

线性范围：精密配制系列浓度为 2～30 μg·mL-1左旋紫草素溶液，作为标准溶液。按照“2.3.1”项色谱条件测定，记录峰面积。以左旋紫草素峰面积(A)为纵坐标、浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归得标准曲线方程。回归方程A=29 617C-2 941.2，r=0.999 9。结果表明，左旋紫草素在2～30 μg·mL-1范围内，浓度与峰面积呈良好线性关系。

精密度：取10 μg·mL-1左旋紫草素溶液，按照“2.3.1”项色谱条件连续测定6次，记录峰面积，考察方法精密度。结果表明，左旋紫草素对照品溶液，重复进样的RSD为0.83%(n=6)，该方法精密度良好。

回收率实验：精密称定已知含量的凝胶样品6份，分别加入一定量左旋紫草素对照品溶液，按“2.3.2”项供试品处理方法处理上述样品，依“2.3.1”项色谱条件测定峰面积，并计算回收率。平均回收率98.84%，RSD1.14%，表明该方法准确度良好。

A.空白凝胶；
B.左旋紫草素对照品；
C.复方紫草微乳-原位凝胶；
1.左旋紫草素。

溶液稳定性：按照“2.3.2”项方法配制供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8 h进样，记录色谱峰面积，并求算RSD，考察样品溶液稳定性。结果表明，供试品溶液室温放置8 h内，左旋紫草素含量无显著变化，RSD为1.37%。

2.3.4样品中左旋紫草素的含量测定 在复方紫草微乳-原位凝胶的最佳处方与工艺条件下，分别制备3批样品(批号：200615，200616，200618)，按照含量测定方法，每批样品测定3次，计算其平均含量。3批凝胶中左旋紫草素的含量分别为75.30，73.52和74.69 μg·mL-1，RSD为1.21%(n=3)。

2.4复方紫草微乳-原位凝胶的理化性质评价

2.4.1外观性状 按照微乳和微乳-原位凝胶优化条件，分别制备复方紫草微乳和微乳-原位凝胶，并对微乳、未胶凝的凝胶液与胶凝后凝胶外观形态进行观察。

复方紫草微乳液为澄清透明紫红色溶液，流动性良好，经10 000 r·min-1离心10 min后稳定不分层；
微乳-原位凝胶在25 ℃时为紫红色且具一定流动性的液体；
34 ℃胶凝后微乳-原位凝胶呈紫红色半固体态(图3)。

图3 复方紫草微乳(A)与微乳-原位凝胶胶凝前后(B、C)外观图

2.4.2粒径与形态测定 取复方紫草微乳和微乳-原位凝胶液，经适量纯化水稀释后于Malvern Nano ZS-90型粒度电位仪平行测定3次，计算平均粒径和粒径分布指数，并测定其Zeta电位。采用透射电镜观察微乳和微乳-原位凝胶在胶凝前后的形态。

复方紫草微乳和微乳-原位凝胶的平均粒径分别为(21.95±0.64)和(23.23±0.29) nm(n=3)，粒径分布指数分别为0.119±0.97和0.190±0.82(n=3)，其粒径分布较集中，且凝胶基质加入对微乳粒径影响较小(图4)。微乳Zeta电位为(-14.44±2.64) mV，表明微乳较稳定。

图4 复方紫草微乳(A)与微乳-原位凝胶(B)粒径分布图

利用透射电镜观察复方紫草微乳和微乳-原位凝胶发生胶凝前后的形态特征(图5)。由图5可知，微乳及胶凝前后的凝胶中，乳滴均呈规则均匀的类球形，粒径较小，且分散性良好，无粘连。

图5 复方紫草微乳(A)、未胶凝(B)与胶凝(C)微乳-原位凝胶透射电镜扫描图

2.4.3黏度和流变学特性考察 将复方紫草微乳凝胶液与模拟阴道液按40：7.5比例混合[17]，采用流变仪，测定非生理条件(25±0.1) ℃和生理条件(35±0.1) ℃下凝胶在不同剪切速率下对应的表观黏度值。微乳-原位凝胶经模拟阴道液稀释后的胶凝温度为34.5 ℃。在非生理条件下，凝胶液黏度值很小，且随剪切速率变化不大；
而在模拟生理条件下形成凝胶后，凝胶呈剪切速率依赖性，随剪切速率的增大，表现出剪切变稀的假塑性，呈非牛顿流体特性。

2.5凝胶的体外释放研究 采用无膜溶出法[14，18]，将复方紫草微乳原位凝胶液10 mL加入已称重的平底带塞西林瓶，置37 ℃恒温振荡器，待其完全胶凝，加入37 ℃预热的模拟阴道液5 mL，作为释放介质，100 r·min-1振荡，每30 min后立刻倾出全部释放介质，并迅速称量此时西林瓶的质量，然后将西林瓶重新放入振荡器，并补充等温释放介质5 mL，反复操作至剩余凝胶量约为总量10%。溶出样品液经孔径0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液照“2.3.1”项色谱条件进样分析，以药物累积释放量对时间作图，得药物释放曲线，并按下式计算药物累计释放百分率。

Cn和Ci分别为第n个和第i个取样点测得的药物浓度(μg·mL-1)；
A为凝胶中药物总量(μg)。复方紫草微乳凝胶的药物累积释放曲线结果见图6。

图6 复方紫草微乳-原位凝胶累积释放曲线

采用DDsolver软件分别用零级、一级动力学及Higuchi方程对凝胶的体外释放曲线进行模型拟合，结果见表2。

表2 复方紫草微乳-原位凝胶体外释药的模型拟合

由方程R2值可知，复方紫草微乳-原位凝胶的药物释放曲线与零级动力学方程拟合较好，药物释放行为符合零级动力学方程，凝胶溶蚀是控制药物释放的主要因素，复方紫草微乳-原位凝胶具有一定的缓释效果。

复方紫草油治疗妇科疾病疗效显著，但传统油制剂纱条存在用药不便、有效成分含量较低等缺点，本研究将其制备成微乳-原位凝胶，兼有微乳和原位凝胶双重优点。与传统制剂相比具有无异物感、药物分布均匀的特点，且其生物黏附性高，可延长药物在给药部位的滞留时间并达到缓释效果，减少给药次数。分别采用三元相图和正交实验筛选微乳及凝胶的最优处方，最终制备的复方紫草微乳-原位凝胶具有良好的理化性质。凝胶经模拟阴道液稀释后，胶凝温度为34.5 ℃，可推断复方紫草微乳-原位凝胶具有温度敏感性，在阴道环境下胶凝为半固体凝胶。该原位凝胶有较好的释药性能，其药物释放行为符合零级动力学方程。

该复方制剂中君药为新疆紫草，其主要有效成分为萘醌类物质左旋紫草素，因此，本实验以左旋紫草素为制剂的指标成分，对其进行含量测定，后续拟增加其他成分的含量测定，逐步完善该制剂的质量标准。复方紫草阴道用微乳-原位凝胶可直接阴道给药，从而显著提高患者的用药依从性。该制剂的阴道刺激性、药效学及药动学特征等有待进一步研究。