日本曲霉酸性蛋白酶的分泌表达、性质及其在猪肉嫩化中的应用

薛意斌， 李 雪， 李延啸， 江正强， 闫巧娟，*

(1.中国农业大学 食品科学与营养工程学院/中国轻工业食品生物工程重点实验室， 北京 100083；
2.中国农业大学 工学院， 北京 100083)

蛋白酶(EC 3.4.11-24)是催化蛋白质水解的一类酶的统称。作为三大工业酶之一，蛋白酯的销售约占全球酶制剂销售额的60%，预计到2026年将接近87亿元[1]。蛋白酶普遍存在于植物、动物以及微生物中，其中微生物具有生长快速、培养简单以及遗传操作方便等特性，是蛋白酶的重要来源[2]。根据底物作用机制及活性中心组成不同，酸性蛋白酶大多属于天冬氨酸蛋白酶，主要微生物来源是霉菌和酵母。近年来，已有许多研究报道了真菌来源的天冬氨酸蛋白酶，主要分为类胃蛋白酶和类凝乳酶。类胃蛋白酶型天冬氨酸蛋白酶主要来自曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderm)和青霉(Penicillium)等[3]；
而类凝乳酶型天冬氨酸蛋白酶主要来自毛霉(Mucor)、根霉(Rhizopus)和内座壳菌(Endothia)等[4]。

随着分子生物学和基因工程技术的快速发展，蛋白酶基因的克隆和表达已成为发掘蛋白酶的一种有效途径。当前用于蛋白酶的表达系统有大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、丝状真菌表达系统等[5]。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)因蛋白翻译后加工机制比较完善、杂蛋白分泌较少、培养成本低、发酵工艺成熟、易于纯化等优点，已成为目前最成熟的蛋白酶真核表达系统[6]。迄今已有多种蛋白酶在毕赤酵母中实现了分泌表达。Shu等[7]将科宁木霉丝氨酸碱性蛋白酶在毕赤酵母中表达，高密度发酵后测得酶活力为15 900 U·mL-1。Ke等[8]将米曲霉中性蛋白酶在毕赤酵母中表达，高密度发酵后测得酶活力高达43 101 U·mL-1。Takenaka等[9]将匍匐曲霉天冬氨酸蛋白酶在毕赤酵母中表达，摇瓶发酵后测得蛋白酶活力仅为1.4 U·mL-1。邱重晏等[10]将粗糙脉孢菌酸性蛋白酶在毕赤酵母中表达，摇瓶发酵后测得蛋白酶活力为6.8 U·mL-1。Guo等[11-12]分别将篮状菌和青霉菌天冬氨酸蛋白酶在毕赤酵母中表达，摇瓶发酵后测得蛋白酶活力分别为67.8 U·mL-1和89.3 U·mL-1。与中性和碱性蛋白酶相比，酸性蛋白酶在毕赤酵母中表达水平相对较低。因此，发掘新型酸性蛋白酶基因，实现在毕赤酵母中高效表达，具有重要理论和实际意义。

蛋白酶可以水解肉类中的蛋白质实现肉的嫩化，同时产生小分子肽增加肉的风味等，已在肉制品加工中广泛应用[13]。目前用于肉类嫩化的蛋白酶大都来源于植物，微生物来源的蛋白酶在肉类嫩化研究方面的报道较少[14]。本研究从日本曲霉(Aspergillusjaponicus)中克隆了一个新型酸性蛋白酶基因，在毕赤酵母中分泌表达，进一步研究其酶学性质和对猪肉嫩化的效果，希望为微生物来源酸性蛋白酶在肉类嫩化中的应用提供理论参考。

1.1 材料与试剂

克隆宿主大肠杆菌DH5α，购自北京全式金生物有限公司；
经密码子优化后AjproA1基因由上海捷瑞生物工程公司合成；
pPIC9K质粒和巴斯德毕赤酵母GS115，购自美国Invitrogen公司。LB(Luria-Bertani培养基)、MD(最小葡萄糖培养基)、YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)、BMGY(缓冲甘油复合培养基)、BMMY(缓冲甲醇复合培养基)、BSM(发酵基础盐培养基)等培养基[15]，购自北京拜尔迪生物技术有限公司。

质粒提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；
限制性内切酶，NEB(北京)有限公司；
胶回收试剂盒，南京诺维赞生物技术公司；
无缝克隆试剂盒，北京博迈德生物公司。木瓜蛋白酶(400 U·mg-1)，北京诺维信生物技术有限公司。其他试剂如无特殊说明均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FUG- 5L型单层玻璃机械搅拌发酵罐，上海国强生化工程装备有限公司；
MyCycler型PCR自动扩增仪，美国BIO- RAD公司；
CBIO- GelPro型凝胶成像分析系统，北京赛百奥科技有限公司；
GL- 20B 型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；
AKTA型蛋白纯化系统，美国GE Healthcare公司；

TA.XT Plus型物性测试仪，英国SMS公司；
TU- 1800PC型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器设备有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1日本曲霉酸性蛋白酶基因的克隆和表达

从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的日本曲霉基因组中发掘到一个酸性蛋白酶基因(Genbank 登录号：RAH76988.1)，基于毕赤酵母偏好性对其进行密码子优化，并交由上海捷瑞生物工程公司合成，名为AjproA1。依据优化后基因序列，设计上游引物AjproA1- F(5′-GCTGAAGCTTACGTAGAATTCGCTCCCTTGGCCGAAACTC-3′)和下游引物AjproA1- R(5′-AAGGCGAATTAATTCGCGGCCGCTCATGCCTGAGCAGCGAAA-3′)。以pUC57- AjproA1载体为模板进行PCR扩增，反应体系(50 μL)：10×TransStart Fast Pfu buffer 5.0 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，Fast Pfu DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1.0 μL，补水至 50.0 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min；
95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，34个循环，72 ℃再延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，与EcoRI和NotI双酶切表达载体pPIC9K进行无缝克隆连接，之后转化至DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR和测序(5′ AOX1: 5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC -3′，3′ AOX1: 5′- GGCAAATGGCATTCTGACATCC -3′)筛选阳性转化子并提取重组质粒pPIC9K-AjproA1。重组质粒pPIC9K-AjproA1用限制性内切酶PmeI进行线性化，经乙醇沉淀回收后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，菌液涂布于MD板于30 ℃培养48 h。挑取MD板上单菌落接种至BMGY培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养，培养24 h后，转接至BMMY培养基中，进行甲醇诱导产酶，每24 h添加体积分数为0.5%的甲醇。培养5 d后8 000 r/min离心5 min，取上清液测定蛋白酶活力。

1.3.2毕赤酵母高密度发酵AjproA1与纯化

根据毕赤酵母发酵指导手册(Version B，053002，Invitrogen)，重组菌株GS115- AjproA1在5L发酵罐进行高密度发酵。种子液在YPD培养基中摇瓶培养至OD600为10.0左右接种，发酵过程分为分批培养阶段、甘油流加阶段和100%甲醇诱导培养阶段，每12 h取样分析蛋白酶活力、蛋白含量和菌体质量浓度。用截留分子质量为5 kDa的膜包对粗酶液进行浓缩并在缓冲液[20 mmol·L-1、pH值为7.0的磷酸盐(PBS)缓冲液]中透析过夜，用20 mmol·L-1、pH值为7.0的PBS缓冲液预先平衡强阴离子交换层析柱QSFF，透析后的粗酶液以0.5 mL·min-1速度上样。利用含500 mmol·L-1NaCl 、pH值为7.0的20 mmol·L-1PBS缓冲液进行线性洗脱，收集洗脱下来具有酶活力的组分，采用SDS- PAGE法分析蛋白纯度，回收纯化后的蛋白于pH值为3.0的柠檬酸缓冲液中透析。

1.3.3AjproA1酶活力和蛋白含量的测定

蛋白酶活力采用福林酚法(GB/T 23527—2009)测定[16]。以酪蛋白为底物，适当稀释酶液，将100 μL酶液和100 μL 质量分数为1%的酪蛋白溶液(pH 值为3.0)混合，于45 ℃反应10 min，加入200 μL的0.4 mol·L-1三氯乙酸(TCA)溶液终止反应。将终止后的反应混合体系于10 000 r/min离心3 min，取100 μL上清液与500 μL浓度为0.4 mol·L-1的碳酸钠溶液混合，最后加入100 μL福林酚试剂，于45 ℃反应20 min，待其冷却后在吸光度值为680 nm下测定其吸光度。以先加入TCA终止反应的酶液作为对照。酶活力单位定义：在pH值为3.0和温度为45 ℃条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需酶量，为1个酶活力单位(U·mL-1)。

以牛血清蛋白(BSA)为标准蛋白，蛋白含量测定参照文献[17]的方法进行。SDS- PAGE参照文献[18]的方法进行。

1.3.4AjproA1酶学性质的测定

1)最适pH值及酸碱稳定性的测定。最适pH值的测定：配制不同pH值体系质量分数为1%的酪蛋白底物溶液，按照标准方法测定不同pH值下的酶活力。以酶活力最高点为100%，分别计算不同pH值条件下的相对酶活力。所用缓冲体系(50 mmol·L-1)及pH值范围：甘氨酸- 盐酸缓冲液(pH值1.5～3.0)、柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液(pH值 2.5～7.5)、Tris-HCl缓冲液(pH值7.0～9.0)。酸碱稳定性测定：用不同pH值的缓冲液稀释酶液，于45 ℃水浴处理30 min，迅速冰浴30 min，按照标准方法测定其残余酶活力；
以未经处理的酶液为对照(100%)，计算不同pH值缓冲液处理下的残余酶活力。

2)最适温度及热稳定性的测定。最适温度测定：用最适pH值缓冲液配制质量分数为1%的酪蛋白底物溶液，在不同温度(30～70 ℃)下按照标准方法测定酶活力。以酶活力最高点为100%，分别计算不同温度条件下的相对酶活力。热稳定性的测定：用最适pH值缓冲液适当稀释酶液后，在不同温度(30～70 ℃)下保温处理30 min，再迅速冰浴30 min，在最适条件下测定残余酶活力。以未经处理的酶液为对照(100%)，计算不同温度处理下的残余酶活力。

3) 金属离子和化合物对AjproA1酶活力影响的测定。将酶液用柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液(50 mmol·L-1，pH值为3.0)适当稀释，与不同金属离子及化合物混匀(终浓度1 mmol·L-1)，置于45 ℃保温处理30 min，迅速冰浴30 min后，在最适条件下测定其残余酶活力。以相同条件下未加入金属离子及化合物的酶液为对照(100%)，计算不用金属离子和化合物处理后比酶活力和相对酶活力。金属离子及化合物包括：Ba2+、Ca2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Li+、Mg2+、Mn2+、Sn2+、Sr2+、Zn2+、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)和曲拉通(TritonX- 100)。

4)蛋白酶抑制剂对AjproA1酶活力影响的测定。利用不同类型浓度的蛋白酶抑制剂[胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin A)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、碘乙酰胺(Iodoacetamid)、乙二胺四乙酸(EDTA)]处理酶液，置于45 ℃保温处理30 min，迅速冰浴30 min后，在最适条件下测定其残余酶活力。以未处理酶液作为对照(100%)，计算不同抑制剂处理后的残余酶活力。

1.3.5AjproA1底物特异性及对酪蛋白水解特性分析

使用柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液(50 mmol·L-1，pH值为3.0) 配制质量分数为1%的酪蛋白、乳清蛋白、脱脂奶粉、偶氮酪蛋白、牛血清蛋白、血红蛋白、大豆分离蛋白、β-乳球蛋白、明胶、卵清蛋白、人血清白蛋白、肌红蛋白、鱼精蛋白和胶原蛋白等，以上述蛋白作为底物，在最适条件下测定酶活力。以酪蛋白为底物时的酶活力为100%，分别计算不同底物下酶活力的相对值。

使用柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液(50 mmol·L-1，pH值为3.0)配制质量分数为1%的α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白底物溶液，在不同底物中分别加入7.5 U·mL-1的重组AjproA1，于45 ℃分别水解0、5、15、30、60 min。通过SDS- PAGE电泳分析AjproA1对不同酪蛋白组分水解能力，并参照Rocha等[19]方法进行水解度测定。

1.3.6AjproA1在猪肉嫩化中的应用

将从超市购买的猪后腿肉剔除可见的结缔组织及脂肪，切成方块称重并记录。配制400 U·mL-1的AjproA1和木瓜蛋白酶酶液，根据肉块质量以20 U·g-1(酶活力/肉质量)进行注射嫩化处理，于4 ℃放置24 h。以未进行嫩化处理和水处理的猪肉作为对照。

蒸煮损失率的测定：称取50 g肉块，放于蒸煮袋中，在80 ℃水浴锅中加热。当肉中心温度达到70 ℃时，取出样品，冷却至室温，用滤纸擦干表面水分，称重，测定蒸煮损失率。蒸煮损失率计算方法[20]见式(1)。

蒸煮损失率=(蒸煮前质量-蒸煮后质量)/
蒸煮前质量×100%。

(1)

剪切力是考察肉类品质的重要指标，通常用来表征肉的嫩度。剪切力测定参照Sun等[21]的方法进行。测定参数：HDP/BS(Warner- Bratzler Shear)探头。测试模式：TPA。肉嫩度测定程序：测试前速度，1 mm·s-1；
剪切速度，1 mm·s-1；
测试后速度，5 mm·s-1；
压缩距离，20 mm。

1.4 数据处理

2.1 AjproA1基因克隆和表达结果分析

该酸性蛋白酶AjproA1基因的克隆与表达结果见图1。以pUC57-AjproA1克隆载体为模板，PCR扩增目的基因，得到长度1 177 bp的片段[图1(a)]。

片段与酶切后的pPIC9K载体进行连接，构建重组表达载体pPIC9K-AjproA1[图1(b)]，并通过菌落PCR验证阳性转化子[图1(c)]，将线性化的重组质粒电转至毕赤酵母GS115中。该基因采用无缝克隆技术在毕赤酵母中表达，通过转化子筛选，测得高产重组菌株摇瓶发酵后酶活力为28.1 U·mL-1。

图1 AjproA1基因的克隆与表达结果Fig.1 Cloning and expression of AjproA1

AjproA1基因全长1 200 bp，编码399个氨基酸，含有N端信号肽(1～20 AA)，通过ExPASy分析可知该蛋白理论预测分子质量和等电点分别为39.5 kDa(剔除信号肽)和4.75。预测无N-糖基化位点，有16个O糖基化位点。AjproA1经BLAST蛋白多重序列比对，分析结果见图2。由图2可知，该蛋白酶编码的氨基酸序列与海枣曲霉(A.phoenicis)来源Aspergillopepsin- 1(GenBank：Q12567.1)[22]同源性最高，为73.0%，与黑曲霉(A.niger)来源Aspergillopepsin- 1(GenBank：P55325.1)[23]同源性为72.5%。根据同源序列比对结果可知：该酸性蛋白酶属于天冬氨酸蛋白酶A1家族，含有DTGS和DTGT两个特征催化序列，推测含有49个氨基酸前导肽，成熟肽编码331个氨基酸蛋白，成熟蛋白预测分子质量为32.5 kDa。结合多重序列比对结果，采用系统邻近法构建系统发育树来分析该酸性蛋白酶AjproA1与其他同源A1家族蛋白酶的进化关系，分析结果见图3。由图3可知，AjproA1不同于进化树中的其他真菌蛋白酶，聚集在一个新的分支上。

序列比对包括日本曲霉(A.j. AjproA1)、海枣曲霉(A.p. Q12567.1)、黑曲霉(A.n.P55325.1)、泡盛曲霉(A.a.P17946.1)、黑曲霉(A.n. A2R3L3.1)、烟曲霉(A.f.BOY1V8.1)、烟曲霉(A.f. A1DDK1)、产红青霉(P.r. B6HL60.1)来源的蛋白酶氨基酸序列。严格保守的特征基序(Asp-Thr-Gly/Thr)用红色框突出显示。红点表示天冬氨酸蛋白酶 A1 家族中潜在催化残基。图2 日本曲霉AjproA1与其他同家族酸性蛋白酶的多重序列比对Fig.2 Multiple sequence alignment of Aspergillus japonicus AjproA1 and other acid proteases from same family

AjproA1蛋白酶氨基酸序列(GenBank登录号：RAH76988.1)，通过BLAST分析获得其他相同A1家族酸性蛋白酶氨基酸序列，采用系统邻接法构建进化树。宿主真菌序列用GenBank 登录号标记。AjproA1显示为红色分支，属于新的未知分支。图3 酸性蛋白酶AjproA1的系统发育树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of acid protease AjproA1

2.2 AjproA1高密度发酵与纯化分析

AjproA1重组菌株的高密度发酵结果见图4。由图4(a)可知，在发酵168 h时菌体质量浓度为383.6 g·L-1，酶活力和蛋白质量浓度分别达669.6 U·mL-1和6.64 mg·mL-1。诱导过程中胞外分泌蛋白组成的SDS- PAGE电泳分析结果如图4(b)所示。由图4(b)可知，随着诱导时间延长，目的条带逐渐变粗，发酵上清液中蛋白分泌含量逐渐增多。将粗酶液经膜包浓缩超滤后，利用QSFF强阴离子交换层析柱一步纯化得到电泳级纯酶见图5。纯化实验结果见表1。表1显示，纯化后的比酶活力由78.9 U·mg-1上升至93.9 U·mg-1，纯化倍数为1.2。

图4 重组毕赤酵母高密度发酵历程和电泳分析Fig.4 Time-course of high cell-density fermentation of recombinant P. pastoris and electrophoretic analysis

目前已成功实现多种蛋白酶在毕赤酵母中分泌表达。已报道酸性蛋白酶在毕赤酵母表达中，大多数产酶水平都较低。密码子优化能够提高密码子的使用频率和适应指数，提高外源蛋白表达量[24]。本研究首次将日本曲霉酸性蛋白酶基因进行密码子优化，并在毕赤酵母中分泌表达，经高密度发酵后测得酶活力为669.6 U·mL-1。AjproA1产酶水平显著高于大多数A1家族天冬氨酸蛋白酶在毕赤酵母中表达水平，如黑曲霉来源酸性蛋白酶(8.76 U·mL-1)[25]、棘孢木霉来源天冬氨酸蛋白酶(18.5 U/mL)[26]和匍匐曲霉来源天冬氨酸蛋白酶(1.4 U·mL-1)[9]。

M. 标准蛋白marker；
1.粗酶液；
2.纯酶。图5 纯化酸性蛋白酶AjproA1 SDS- PAGE分析Fig.5 SDS- PAGE analysis of purified acid protease AjproA1

表1 重组酸性蛋白酶AjproA1的纯化结果

2.3 AjproA1的酶学性质分析

AjproA1的酶学性质研究结果见图6。图6(a)及图6(b)表明，AjproA1的最适pH值为3.0，在pH值为3.0～6.0的缓冲液中处理30 min后仍保留80%以上残余酶活力。图6(c)及图6(d)表明，AjproA1的最适温度为45 ℃，在40 ℃下处理30 min后仍保留80%以上残余酶活力。本实验中所用金属离子和化合物对酶活力的影响见表2。表2显示，金属离子Mn2+对酶活力无明显影响，其余金属离子对酶活力均有不同程度抑制作用；
化合物对酶活力也均有不同程度抑制作用，而SDS几乎全部抑制酶活力，残余相对酶活力为1.5%(P<0.05)。不同类型蛋白酶抑制剂对AjproA1酶活力影响见表3。表3显示，4种蛋白酶抑制剂对AjproA1均有不同程度抑制作用，金属蛋白酶抑制剂EDTA和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对酶活力有较大影响，半胱氨酸蛋白酶抑制剂Iodoacetamide对酶活力没有显著影响。当胃蛋白酶抑制剂Pepstatin A浓度为0.01 mmol·L-1时，酶活力受到完全抑制，表明该蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶。

图6 AjproA1的酶学性质分析Fig.6 Enzymatic properties analysis of acid protease AjproA1

表2 金属离子和化合物对AjproA1活力的影响

表3 蛋白酶抑制剂对AjproA1活力的影响

大多数真菌来源酸性蛋白酶的最适pH值为3.0～5.5，在pH值为3.0～6.0时保持稳定[21]。AjproA1的最适pH值为3.0，与大多数真菌来源酸性蛋白酶相似，但高于黑曲霉来源酸性蛋白酶PepAb(pH值为2.5)[27]，低于棘孢木霉来源TAASP[28](pH值为4.0)和米曲霉来源PepA[29](pH值为4.5)。不同来源酸性蛋白酶的最适反应pH值不同，可能与酶活性中心含有的羧基有关[30]。大多数研究报道真菌酸性蛋白酶最适温度在50～60 ℃。AjproA1的最适温度为45 ℃，低于大多数真菌来源的酸性蛋白酶，如黑曲霉酸性蛋白酶PepAb(50 ℃)[31]和米曲霉酸性蛋白酶PepA(55 ℃)[32]。金属蛋白酶抑制剂EDTA对AjproA1酶活力有较大影响，说明某些离子对酶的稳定性或其活性很重要[21]。

2.4 AjproA1的底物水解特异性及对酪蛋白水解特性分析

AjproA1对多种蛋白质底物的水解活性测定结果见表4。表4显示，该蛋白酶表现出广泛底物特异性，对血红蛋白表现出最高水解活力(116.9%)，高于酪蛋白(100.0%)；
其余依次为肌红蛋白(65.4%)、人血清蛋白(53.8%)、脱脂乳(43.1%)、β-乳球蛋白(41.5%)、牛血清白蛋白(38.5%)等，但对鱼精蛋白无活性。AjproA1对不同酪蛋白水解特性分析结果见图7。由图7可知，AjproA1能在不同程度上水解酪蛋白的3种组分(α、β和κ-酪蛋白)，生成分子质量较小的肽段。图7(a)表明，3种酪蛋白的水解度随水解时间延长在逐渐增加，且在水解60 min时，κ-酪蛋白表现最高水解度(16.65%)，其次为β-酪蛋白(13.38%)、α-酪蛋白(10.89%)。图7(d)表明，水解5 min后，AjproA1将κ-酪蛋白主条带彻底水解。图7(b)和图7(c)表明，随水解时间延长，α-酪蛋白和β-酪蛋白主条带呈现逐渐变浅趋势。本研究结果表明，AjproA1对不同酪蛋白组分水解能力有较大差异，对κ-酪蛋白表现出最高的水解能力。

表4 AjproA1的底物水解特异性

不同微生物来源酸性蛋白酶表现出不同的底物水解特异性。Guo等[12]报道的酸性蛋白酶PsAPA对酪蛋白表现出最高水解活力，能够水解鱼精蛋白，不能够水解胶原蛋白、卵清蛋白；
Sun等[21]报道的酸性蛋白酶RmproA也对酪蛋白表现出最高水解活力，能够水解卵清蛋白，不能够水解鱼精蛋白和胶原蛋白。二者与AjproA1的底物水解特异性表现出较大差异。AjproA1对不同酪蛋白水解特性与Wang等[33]报道的MoringaoleiferaSeeds来源天冬氨酸蛋白酶对κ-酪蛋白表现出最高水解能力的情况相似；
然而Sun等[21]报道的米黑根毛霉来源酸性蛋白酶RmproA对α-酪蛋白表现出最高水解能力。说明不同来源酸性蛋白酶对酪蛋白中不同组分的水解能力具有差异性。

图7 AjproA1对不同酪蛋白的水解特性Fig.7 Hydrolysis properties of AjproA1 for different casein

2.5 AjproA1在猪肉嫩化中的应用

嫩化实验以蒸煮损失率和剪切力为指标，考察了AjproA1对猪肉的嫩化效果，结果见表5。表5显示，与对照组相比，经水、木瓜蛋白酶和AjproA1处理的猪肉蒸煮损失率均有不同程度增加(P<0.05)；
AjproA1与木瓜蛋白酶相比，AjproA1对猪肉的蒸煮损失率(19.55%)低于木瓜蛋白酶(22.73%)，表明AjproA1在持水力方面优于木瓜蛋白酶；
同时与对照组相比，经水、木瓜蛋白酶和AjproA1处理的猪肉都表现出剪切力下降，且木瓜蛋白酶和AjproA1对猪肉剪切力无显著差异(P>0.05)。本研究结果表明，AjproA1具有作为嫩肉剂的潜力。

表5 AjproA1对猪肉的嫩化效果

从日本曲霉中克隆了一个新型酸性蛋白酶基因(AjproA1)，该酶属于天冬氨酸蛋白酶A1家族。将AjproA1密码子优化后在毕赤酵母中实现分泌表达，经5L发酵罐高密度发酵后测得酶活力为669.6 U·mL-1。AjproA1最适反应温度45 ℃，最适pH值为3.0，在pH值为3.0～6.0保持稳定。与其他酸性蛋白酶的特性相比，AjproA1较低的温度特性更有利于低温条件下肉的嫩化和蛋白质水解。不同于大部分真菌来源的酸性蛋白酶对酪蛋白表现出最高催化活性，AjproA1对血红蛋白具有最高催化活性。与α-酪蛋白和β-酪蛋白相比，AjproA1更能有效地水解κ-酪蛋白。AjproA1对猪肉进行嫩化的结果表明，AjproA1具有作为嫩肉剂的潜力。本研究结果旨在为食品工业中肉类嫩化蛋白酶的开发和应用提供理论依据。