长茎葡萄蕨藻对温度胁迫的生理响应机制

李恬静薇，马彬，邹潇潇，朱军，鲍时翔

（1.河北农业大学海洋学院，河北 秦皇岛 066000；
2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室，海南 海口 571101）

长茎葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）隶属绿藻门（Chlorophyta）、羽藻纲（Bryopsodophyceae）、蕨藻属（Caulerpa），俗称“海葡萄”，是一种在热带地区广泛分布的大型经济绿藻，具有很高的经济价值和生态价值[1]。长茎葡萄蕨藻营养丰富，含有多种人体必需的氨基酸、维生素[2]、矿质元素和不饱和脂肪酸，且脂肪含量低，是潜在的高营养价值保健食品，在日本和东南亚都被视为高级食材。长茎葡萄蕨藻还可为海洋动物提供饵料以及良好的栖息环境，对改善海洋环境，提高生物多样性和维护生态系统平衡具有重大意义[3]。长茎葡萄蕨藻养殖业兴起于日本，而后传到菲律宾、马来西亚、越南、韩国和中国台湾等地，目前在中国的东南沿海城市已经开始了大规模的养殖，逐渐形成一条新兴大型海藻产业链，丰富了我国传统大型海藻养殖产业[4]。

盐度、温度、光照和水流等生态因子都影响长茎葡萄蕨藻的养殖效果，其中温度的影响最大，是茎葡萄蕨藻生长发育的限制因素[5]。长茎葡萄蕨藻最适生长温度在25℃～30℃之间，27℃时生长速率最快[6]。当温度低于18℃或高于30℃时均会出现藻体白化现象[7]。目前长茎葡萄蕨藻主要在海南省沿海一带在室外池塘养殖，水位较浅，养殖池内水温受外界温度影响较大。冬季水温最低可达15℃，夏季持续的高温和阳光照射，部分养殖池内水温最高达37℃（海南省昌江养殖基地测量）。温度胁迫影响藻类的各种生理生化过程，如高温胁迫可抑制光合作用，破坏活性氧代谢平衡，给机体造成不可逆的损伤等，严重时甚至死亡[8]；
低温胁迫主要损伤藻类的细胞膜系统，破坏膜的结构，使蛋白质变性，还可以导致脂膜过氧化，破坏细胞内外渗透压平衡等[9]。为抵抗温度胁迫，藻类通常在短时间内就可以迅速做出响应。目前，有关长茎葡萄蕨藻的研究大多是温度对其生长的影响，对温度胁迫的响应机制还不太明确。为了解长茎葡萄蕨藻抵抗温度胁迫的遗传机理，挖掘抵抗温度胁迫的关键基因和代谢通路，培育抗逆优良品系，研究温度胁迫对长茎葡萄蕨藻的响应机制至关重要。

本文通过研究长茎葡萄蕨藻光合系统、氧化和抗氧化系统和渗透调节物质对低温（15℃）和高温胁迫（37℃）的短期应激响应机制，可为系统研究长茎葡萄蕨藻在温度胁迫下的应激调控机制提供理论基础。

1.1 材料

实验用的长茎葡萄蕨藻样品来自本实验室在海南省昌江长茎葡萄蕨藻养殖基地。挑选健壮、生长状态良好的藻体样品，用无菌海水清洗3 次后，在光照培养箱（PGX-450D，宁波赛福）中暂养一周后进行处理。培养期间，温度（27±1）℃，光强40 μmol·m-2·s-1，盐度30，光暗周期为12h∶12h。光照强度由光量子测定仪（MQ-200,Apogee Instruments,USA）测定。本研究所用试剂盒来自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

在洁净的1 L 烧杯中分别加入800 mL 无菌海水和适量洁净藻体，分别置于27℃（对照）、15℃（低温）和37℃（高温）光照培养箱中培养，每组3 个重复。预实验中，温度胁迫24 h 可显著影响长茎葡萄蕨藻，24～48 h 之间藻体开始陆续死亡，因此，确定处理时间为24 h，于1 h、2 h、4 h、8 h、12 h 和24 h时，测量叶绿素荧光参数（最大光量子产量），并取样，用纸擦干藻表面水分，迅速放于液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱中储存。单独取3 株样品迅速置于显微镜下观察和拍照。

1.3 生理指标的测定

用MINI-PAM（Walz,Effeltrich,Germany）测定最大光量子产量，样品暗处理适应20 min 后，首先提供0.3 μmol·m-2·s-1的测量光，测得最小荧光值（F0），然后提供0.8 s 约4 000 μmol·m-2·s-1的饱和脉冲，测得最大荧光值（Fm）。最大光量子产量（Fv/Fm）由以下方程计算求得：Fv/Fm=（Fm-F0）/Fm[10]。其他生理指标的测定均采用分光光度法。叶绿素含量采用无水乙醇和丙酮1∶2（v∶v）充分混合配制成的提取液提取后测定；
丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[10]；
超氧化物歧化酶活力的测定采用羟胺法[11]；
脯氨酸含量采用酸性茚三酮显色法测定；
可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法[10]。以上实验步骤参考南京建成试剂盒说明书操作，使用紫外可见光分光光度计（756PC，上海光谱）进行测量。

1.4 数据分析

本实验采用Excel 对数据进行分析和作图，用IBM SPSS Statistics 26 软件进行统计分析，包括单因素方差分析、多重比较及相关性分析。

2.1 温度胁迫对长茎葡萄蕨藻外观形态的影响

高、低温胁迫显著影响长茎葡萄蕨藻的外观形态。正常条件下，长茎葡萄蕨藻颜色均匀，藻体饱满，处理1 h 时出现色素聚集，随胁迫时间的延长聚集区域逐渐增加，球状小枝颜色变浅，12 h 时开始出现脱水现象，24 h 时脱水现象明显，表皮褶皱，藻体变软（图1）。

2.2 温度胁迫对长茎葡萄蕨藻光合作用的影响

正常条件下长茎葡萄蕨藻最大光量子产量（Fv/Fm）在0.75～0.80 之间（图2）。在27℃下长茎葡萄蕨藻最大光量子产量无明显变化，在高温和低温胁迫下Fv/Fm随处理时间的延长逐渐降低，处理24 h 后分别比初始值下降了62.6%和68.7%。在低温胁迫下，长茎葡萄蕨藻的Fv/Fm下降趋势比高温胁迫显著。方差分析表明，低温胁迫下1 h 时就出现了极显著差异（P<0.01），高温胁迫下1 h 出现显著差异（P<0.05），2 h 时出现极显著差异（P<0.01）（图2）。

不同温度胁迫下，长茎葡萄蕨藻叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量分别在0.046～0.070 mg·g-1、0.040～0.057 mg·g-1和0.089～0.128 mg·g-1之间波动。各处理组间没有随胁迫时间的延长而表现出显著性差异，说明24 h 以内的温度胁迫并未显著影响长茎葡萄蕨藻的叶绿素含量（图3）。

2.3 温度胁迫对长茎葡萄蕨藻氧化抗氧化系统的影响

低温胁迫下，长茎葡萄蕨藻体内丙二醛含量随处理时间的延长先上升后下降，但并未达到显著水平，8 h 后达到最高值。高温胁迫前期，长茎葡萄蕨藻体内丙二醛含量并未出现明显变化，24 h 后显著降低（图4）。长茎葡萄蕨藻体内超氧化物歧化酶活力随低、高温胁迫时间的延长而升高，24 h 后比对照组分别上升了33.4%和46.2%，高温胁迫的上升趋势较为显著。高温胁迫2 h 与对照组差异显著（P<0.05），低温胁迫4 h 差异显著（P<0.05）（图5）。

2.4 温度胁迫对长茎葡萄蕨藻两种渗透调节物质含量的影响

温度胁迫使长茎葡萄蕨藻体内脯氨酸含量升高。在正常温度（27℃）下，长茎葡萄蕨藻体内脯氨酸含量较为稳定，在15℃和37℃下，脯氨酸含量随处理时间的延长而上升，24 h 后分别比初始值升高了20.7%和142.3%，高温胁迫下脯氨酸含量的升高幅度明显高于低温胁迫。与对照组相比，低温胁迫8 h 时差异显著（P<0.05），12 h 时差异极显著（P<0.01）；
高温胁迫2 h 时差异显著，低温胁迫4 h时差异极显著（P<0.01）（图6）。低温和高温胁迫同样会导致长茎葡萄蕨藻体内可溶性糖含量升高，24 h 后分别比初始值上升了61.1%和73.8%。方差分析表明，与对照组相比，低温胁迫4 h 后差异显著（P<0.05），高温胁迫2 h 后差异显著（P<0.05）（图7）。

3.1 长茎葡萄蕨藻光合系统对温度胁迫的响应

光合作用是植物最重要的生长反应之一，光合速率直接决定着植物的生长力。温度胁迫对长茎葡萄蕨藻光合系统的影响可以通过最大光合速率和叶绿素含量的变化来反映。光系统Ⅱ最大光量子产量（最大光合效率）Fv/Fm可以反映植物的潜在最大光能转换效率。在健康生理状态下，绿藻的最大Fv/Fm一般在0.7～0.8 之间。Fv/Fm下降代表机体受到胁迫，光合作用被抑制[12]。Guo 等[13]研究发现：温度和光照胁迫使长茎葡萄蕨藻Fv/Fm下降。本研究中，长茎葡萄蕨藻Fv/Fm在温度胁迫1 h 时就显著下调，是最先表现出显著差异的生理指标，说明长茎葡萄蕨藻光合系统对温度胁迫十分敏感，当处于不适宜的温度条件下时，光合作用最先受到抑制。这种现象在其他藻类中也曾被证实[14]。在低温胁迫下长茎葡萄蕨藻Fv/Fm的下降速率明显高于高温处理组，说明低温胁迫对长茎葡萄蕨藻光合作用的抑制作用更为显著。而温度胁迫下长茎葡萄蕨藻叶绿素含量未发生显著性变化，说明24 h 温度胁迫并不影响叶绿素含量，叶绿素合成酶的活性没有受到明显抑制，光合速率的下调则可能是光系统结构（如PSII的放氧复合体、光吸收天线、反应中心、电子受体侧和电子供给侧）受损，抑制了光合作用。温度胁迫时发现，长茎葡萄蕨藻颜色变浅，可能是长茎葡萄蕨藻叶绿体在细胞内自由移动形成的色素聚集所致。推测这种色素聚集现象可能是长茎葡萄蕨藻主动抵抗温度胁迫而产生的一种防御机制。

3.2 长茎葡萄蕨藻抗氧化系统对温度胁迫的响应

在温度胁迫下，细胞中的许多代谢通路会受到抑制并产生大量的活性氧。过量活性氧和自由基的累积会损伤蛋白质、DNA、脂质和其他细胞结构物质，氧化影响其正常的生理功能。丙二醛（MDA）为膜脂过氧化产物，可与膜结构上的酶和蛋白质结合而使其失去活性，破坏膜结构，因此，可以根据植物细胞内MDA 的含量来判断细胞膜系统受损程度[15]。低温胁迫下长茎葡萄蕨藻体内丙二醛含量先升高后降低，但差异并不显著；
高温胁迫下长茎葡萄蕨藻体内丙二醛含量前期无显著差异，24 h 后有一定程度的降低，说明温度胁迫24 h 产生的活性氧并未显著影响长茎葡萄蕨藻膜系统，这可能是长茎葡萄蕨藻具有有效的活性氧清除能力，也可能是长茎葡萄蕨藻体内含有大量的胶质和多糖保护了细胞膜系统。胁迫产生的活性氧可以激活藻类的抗氧化系统，使其有效的清除活性氧来抵抗温度变化的胁迫[16,17]，但当胁迫超过一定范围时，会直接损伤细胞内的蛋白质结构，使酶失去活性[18]。超氧化物歧化酶可将超氧自由基转变成H2O2，以此来消除活性氧对机体的损伤。李虎等[19]研究发现，低温处理（20℃、17℃、14℃）2 h 后，长心卡帕藻（Kappaphycus alvarezii）体内SOD 活力显著上升。本实验中，低温和高温胁迫下长茎葡萄蕨藻体内SOD 活力都有显著上调趋势，高温胁迫下SOD 活力变化较为迅速，表明低温和高温胁迫下长茎葡萄蕨藻体内超氧自由基含量增多，藻体处于胁迫状态，但在胁迫24 h内并未损伤抗氧化系统，依然可以通过提高SOD 的活力来清除温度胁迫产生的过量活性氧，高温胁迫下SOD 活性氧清除能力更强。

3.3 长茎葡萄蕨藻渗透性调节系统对温度胁迫的响应

温度胁迫12 h，长茎葡萄蕨藻脱水，细胞质收缩，表皮出现褶皱。Ko 等[20]在高温处理的单细胞藻中也发现了这种细胞质收缩现象，说明温度胁迫通常也会导致渗透压胁迫。藻类为保持细胞的完整，可通过改变渗透调节物质的含量来抵抗胁迫。脯氨酸为最重要的渗透调节物质之一，具有清除自由基的功能[21]。在低温和高温胁迫72 h 后，龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）中脯氨酸含量分别增加了44.9%和69.8%[22]。正常条件下，长茎葡萄蕨藻脯氨酸含量较低，温度胁迫后，脯氨酸含量迅速升高，尤其是高温胁迫下，24 h 后上升量高达140%。说明脯氨酸在长茎葡萄蕨藻抵抗温度胁迫，尤其是高温胁迫中发挥重要作用。植物细胞内的可溶性糖不仅可以避免温度胁迫所引起的蛋白质变性，保护蛋白质，还可以维持细胞膜的稳定性，通过自身含量的变化减少水分流失，使细胞渗透势保持平衡，以达到保护细胞的目的[23,24]。长茎葡萄蕨藻可溶性糖含量较高，除具有生物组织常见的几种可溶性糖外，还含有海藻糖等物质[25]。有研究发现，低温胁迫处理下的两种南极冰藻（衣藻Chlamydomonas sp.L-4和塔胞藻Pyramidomonas sp.L-1）和钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）可溶性糖含量都有明显增加[26,27]。本研究中，在低温和高温胁迫下，长茎葡萄蕨藻体内可溶性糖含量都有一定程度的升高，但上升幅度远远小于脯氨酸上升幅度。温度胁迫长茎葡萄蕨藻可以通过增加脯氨酸和可溶性糖来抵抗胁迫，其中脯氨酸发挥作用较大。实验观察和对实验结果的综合分析表明，温度胁迫下长茎葡萄蕨藻生长状态与渗透压调节系统关系密切，推测温度胁迫导致的渗透压胁迫可能是长茎葡萄蕨藻生理机能受损的主要原因。

3.4 结论

长茎葡萄蕨藻对温度变化十分敏感，短时间的温度胁迫能抑制其光合速率；
长茎葡萄蕨藻可通过激活抗氧化系统，提高超氧化物歧化酶SOD 的活性来抵抗温度胁迫带来的过氧化损伤；
通过在体内积累脯氨酸和可溶性糖等渗透调节物质来保护细胞的完整，维持正常的生理功能；
低温胁迫对长茎葡萄蕨藻光合系统的影响更大，而高温胁迫对抗氧化系统和渗透调节系统影响较大。本研究为系统研究长茎葡萄蕨藻在温度胁迫下的应激调控机制提供了理论基础。