广西地区家畜牛、羊体表硬蜱情况调查及种类鉴定

周庆安，黄胜斌，莫胜兰，胡丽萍，韩银华，甘 雨，蓝惠华，林立亮，韦海娜，何奇松，韦显凯，施开创，李 军，郭建刚

蜱隶属节肢动物门(Arthropoda，蛛形纲(Arachnida)，蜱螨亚纲(Acari)，寄螨总目(Parasitiformes)，蜱目(Ixodida)。下分硬蜱科(Ixodidae)，软蜱科(Argasidae)，钠蜱科(Nuttalliellidae)，其中最常见、危害最大的是硬蜱科，包括13个属，其中有7个属与兽医关系密切。硬蜱寄生在家畜的体表，叮咬吸动物血液，引起宿主贫血、消瘦、皮肤炎症反应，严重危害畜牧业的健康发展，造成严重的损失，还能传播细菌、病毒、寄生虫等病原体，近几年来，因蜱虫咬人引发的传染病常有发生，显然蜱和蜱传疾病的危害已成为一个重大的社会公共卫生问题。

硬蜱适合在温暖潮湿的环境生长、发育、繁殖。广西地处热带和亚热带地区，一年四季温暖多雨的气候，地貌多属丘陵，植被茂盛，生态环境易滋生蜱虫。牛、羊是硬蜱的易感动物，在广西牛和羊多以散养或半圈半散养方式为主，与人活动的关系也较为密切。因此，通过现场调查广西各地区牛、羊硬蜱携带情况，掌握硬蜱在广西各地区家畜牛、羊分布情况，以及利用形态鉴定结合16S rDNA和COI生物分子标志了解种类组成，为防控家畜牛、羊蜱虫病和预防蜱媒传染病提供参靠依据。

1.1 主要仪器和试剂 柱式DNA核酸提取试剂盒购于哈尔滨元亨生物药业有限公司(生产批号：YDNA-TQ 20200515P)，2×Tapplus PCR Maste mix、大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DH5α感受态细胞、PMDTM18-T克隆载体、DL 2000 DNA Marker，购于宝日医生物技术(北京)有限公司；
光学显微镜(MOTIC)、Bionetra TONE PCR仪、凝胶成像系统(UVITEC)、电泳仪购于北京六一仪器厂。

1.2 硬蜱样品采集 从2019年1月至2021年11月，根据广西14个市牛羊养殖情况，前往14个市46个县区43户散养牛，49个牛场，4户散养羊，42个羊场，进行硬蜱采样。观察牛羊家畜耳朵、腹股沟等体表是否有硬蜱寄生，然后采集放置昆虫管中保存，总共采集2 030只硬蜱。

1.3 硬蜱形态学鉴定 运用光学显微镜观察硬蜱的肛沟、盾板、眼、假头基、须肢、口下板、气门板、足基节有无分距、几丁质板等形态特点，然后根据陈泽等[1]发表的中国蜱类系统分类文献，结合《医学蜱螨学》蜱类分类检索表进行蜱类标本形态学种、属鉴定。

1.4 引物合成信息 运用PCR方法扩增蜱16S rDNA和COI基因片段。16S rDNA和COI基因引物序列分别参靠Norris[2]和Vrijenhoek[3]。引物序列由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。引物信息如表1。

表1 蜱16S rDNA和COI基因片段扩增引物Tab.1 Primers for 16S rDNA and COIsequences

1.5 硬蜱分子学鉴定

1.5.1 硬蜱组织核酸抽提 根据形态学鉴定的初步结果，每个采样点取一只硬蜱进行分子学鉴定，其中柳州2只，南宁5只，北海2只，贺州2只，百色3只，防城港1只，河池6只，梧州3只，桂林2只，崇左2只，贵港6只，玉林1只，来宾1只，钦州市1只。根据硬蜱吸血程度优先选取游离硬蜱，其次半饱血和饱血进行硬蜱组织核酸抽提。硬蜱洗净后，把组织研磨成匀浆状后，加入20 mg/L的蛋白酶K和裂解液后放置56 ℃水浴中进行消化4 h，按照柱式DNA核酸提取试剂盒说明书进行抽提核酸，DNA保存于-20 ℃待用。

1.5.2 硬蜱16S rDNA、COI基因扩增 反应体系25 μL包括2×TaqMasterMix 12 μL，ddH2O 9 μL，上下游特异性引物各0.5 μL，抽提核酸3 μL，在95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s， 55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s， (34 cycles)；
72 ℃ 10 min条件下运行完成扩增。取7 μL PCR产物加入1.5%的琼脂糖凝胶，放入电泳仪在100 V， 66 mA条件下30 min电泳后，在凝胶成像系统观察是否有特异性亮带。

1.5.3 硬蜱16S rDNA、COI基因序列测序 经16S rDNA，COI特异性引物扩增后，取PCR产物进行凝胶电泳，回收16S rDNA, COI目的片段，并在4 ℃条件下连接至PMD18-T后，转化至DH5α感受细胞，转化至LB固体培养基扩大培养24 h，挑起可疑菌落至LB液体培养基扩大培养，经PCR鉴定是阳性菌落后，送至广州华大基因科技有限公司测序。

1.5.4 序列分析和系统发育树的建立 将本次成功测序的16S rDNA、COI基因序列在NCBI中注册的序列进行同源性对比，和GenBank上登录的硬蜱科各属种相应的基因序列相似度比较，16S rDNA选取微小扇头蜱(Rhipicephalusmicroplus)(JX051068、MN650726)、长角血蜱(Haemaphysalislongicornis)(KJ710091、KJ652225)、具角血蜱(H.cornigera)(AB819174)、亚东离眼蜱(Hyalommaasiaticum)(MG669107)、黑斑革蜱(Dermacentoratrosignatus)(MT912973)、美洲花蜱(Amblyommaamericanum)(L34314)、卵形硬蜱(Ixodesovatus)(MW063846)作为参照序列，COI选取种内不同区域的微小扇头蜱MT249801(比利时)、OK083457(百色)、OK083467(黄石)、MH788941(湖南)、JX051125(云南)、OM368329(武汉)、JQ737082(甘肃)；
长角血蜱属：MT465133(西安)、MT465129(汉中)、KY488667(山东)、MK408610(湖北)、OM368291(湖北)、MW642399(辽宁)；
具角血蜱属：OM368283(江西)；
血蜱属未定种：MH208698(山东)为参照序列。用MEGA5.2软件中的Neighbor-Joining Tree，经过1 000次的 Bootstrap计算，构建系统发育树。

2.1 各市牛羊场硬蜱寄生情况 在广西14个地市中均采集到硬蜱，其中43户散养牛均有硬蜱寄生，4户散养羊有硬蜱寄生，29个牛养殖场和11个羊养殖场有硬蜱寄生。采集的硬蜱大多为寄生蜱，处于饱血或半饱血状态，在一些体表被毛较长的宿主中收集少数游离蜱，各市牛羊养殖场有硬蜱寄生情况见表2。

2.2 形态学鉴定结果 经光学显微镜观察硬蜱的形态结构后，根据文献将肛沟很浅而不明显，假头基六角形，足基节Ⅰ有两个粗短的距，其大小约相等的硬蜱鉴定为微小扇头蜱(图1-A、B)。小型蜱，假头基矩形，无眼，雌性下口板齿式5/5，或至少主部5/5，雄性下口板齿式5/5，盾板刻点中等粗细，分布稠密而均匀的硬蜱鉴定为长角血蜱(图1-C、D)。假头基矩形，无眼、口下板齿式5/5，须肢第3节宽小于长，气门板背突不明显的硬蜱鉴定为具角血蜱(图1-E、F)。其中微小扇头蜱共1 968只，是广西地区硬蜱种类分布优势种，分布广西14个地市，宿主：牛、羊；
而长角血蜱49只，分布于河池地区，宿主牛；
具角血蜱13只，分布于河池地区和崇左凭祥市地区，宿主牛。各市蜱侵染宿主百分率详见图2。

表2 广西地区各市牛羊场硬蜱调查结果Tab.2 Ixodes infection in cattle and sheep farms in Guangxi

2.3 分子学鉴定结果 微小扇头蜱、长角血蜱、具角血蜱的16S rDNA基因片段大小为470 bp，而微小扇头蜱、长角血蜱、具角血蜱的COI基因片段大小为710 bp，与预期相符合。经测序后获得33条微小牛蜱序列，其中柳州2条、南宁5条、北海2条、贺州2条、百色3条、防城港1条、河池3条、梧州3条、桂林2条、崇左1条、贵港6条、玉林1条、来宾1条、钦州1条；
2条长角血蜱序列：河池2条；
2条具角血蜱序列：河池1条，崇左1条。

2.4 序列分析和系统发育树结果 将成功测序的16S rDNA、COI基因序列在NCBI中注册的序列进行同源性对比，与同种类相似度达90%以上。根据同源性及序列的数量选取序列构建系统发育树。它们与参照的同属蜱种序列在一个大支上，不同属的蜱种在不同的大分支，如图3、4。

A：微小扇头蜱腹面；
B：微小扇头蜱背面；
C：长角血蜱腹面；
D：长角血蜱背面；
E：具角血蜱背面；
F：具角血蜱腹面(30×)。图1 硬蜱形态结构Fig.1 Morphological structure of ixodes

图2 牛、羊体表硬蜱种类地理分布情况Fig.2 Geographical distribution of ixodes ticks on body surfaces of cattle and sheep

图3 基于16S rDNA基因不同蜱种的进化树Fig.3 Phylogenetic analysis of tick species based on partial 16S rDNA gene sequences

图4 基于COI基因不同蜱种的进化树Fig.4 Phylogenetic analysis of tick species based on partial COI gene sequences

硬蜱是家畜一种常见的体表寄生虫，也是一种媒介生物。本次调查在广西14个地市牛、羊场捕获的硬蜱隶属1科2属3种，其中微小扇头蜱是优势种，硬蜱在广西分布广，每个季节均可感染。散养户比规模场阳性率高，牛场比羊场阳性率高。硬蜱近几年因咬人而发生传染病事件，使防控硬蜱知识在养殖户得到普及和重视，规模化养殖场通过药浴或注射杀虫药进行定期杀虫防控硬蜱。走访入户采集蜱虫得知羊喜食绿叶植物，而一些地区的绿叶植物具有驱虫的效果，因此，一些地区羊场带虫率相对较低。药物防控硬蜱有一定的成效，但硬蜱繁殖能力强、周期短、对环境适应强，因此防控硬蜱是一项长期艰巨的任务。

16S rDNA、COI是线粒体基因组成部分，是鉴定蜱的有效基因，本次运用16S rDNA用于分析广西微小扇头蜱、长角血蜱、具角血蜱种属关系。16S rDNA进化树显示的各属间系统关系：扇头蜱属、革蜱属、离眼蜱属聚为一类，又与血蜱属聚为一类，而广西各地区的微小扇头蜱、长角血蜱、具角血蜱各与参靠序列同处于大分支中。16S rDNA序列含有信息位点较多，引物可扩增的物种范围广[4-5]，适合用于种属关系的分析。而COI基因的进化速率较16S rDNA快，且COI基因中插入与缺失情况较少[6-7]，因此选取GenBank公布的部分国内和国外微小扇头蜱、长角血蜱、具角血蜱的COI序列分别与广西对应种类进行分析，进化树显示微小扇头蜱、长角血蜱、具角血蜱形成大分支，而大分支中不同地方的微小扇头蜱、长角血蜱、具角血蜱又各自形成小分支，显示地理分布的差异。

中国硬蜱种类丰富共计2科10属117种[8-9]，采集的方法有动物体表采集法和人工布旗法，采集区域涉及各种动物体表、自然保护区的森林和草地、山区、边境地区等。本次调查广西地区牛羊体表的蜱虫隶属1科2属3种，其中微小扇头蜱是优势种，而何成为等[10]人在广西中越边境地区捕获的硬蜱隶属于1 科4属7种，优势种为微小牛蜱和粒形硬蜱。亚红祥等[11]人在滇西横断山区家畜体表蜱类捕获的硬蜱隶属1科1属4种，微小扇头蜱为优势种。余向华等[12]人在浙江温州从各类宿主动物体表捕获硬蜱隶属1科4属7种，长角血蜱为优势种。高杨等[13]人在河北承德市塞罕坝自然保护区森林、草地、灌丛捕获的硬蜱隶属1科2属2种，其中全沟硬蜱为优势种。刘欢欢[14]收集森林地区的硬蜱，其中吉林省有3属4种蜱，黑龙江省有3属5种蜱，全沟硬蜱是吉林省、黑龙江省共有优势蜱种。韩蓉[15]在青海省捕获的蜱隶属1科 3属7种，青海血蜱是优势种。不同纬度影响硬蜱的种类组成，全面准确掌握不同地区不同宿主的硬蜱种类和优势种，监测了解携带蜱媒传染病的种类，对当地公共卫生预防蜱媒传染病起到预警作用。

利益冲突：无

引用本文格式：周庆安，黄胜斌，莫胜兰，等. 广西地区家畜牛、羊体表硬蜱情况调查及种类鉴定[J].中国人兽共患病学报，2022，38(11)：1039-1044. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.143