SOCS基因家族在肝细胞癌中的表达及生物信息学分析

卜文超 曾宪智 关云茜 谢思源 陈世新 汤挺兵 曹明国

丽水学院医学院，浙江 丽水 323000

在世界范围内，肝癌是癌症相关死亡疾病的 第4大常见原因，发病在癌症中居于第6位，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝细胞癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）最主要类型，约占PHC患者的80%［2］。HCC有多种治疗方法，包括手术切除、化疗、放疗、肝脏移植等，但高复发转移率导致HCC的预后仍然很差［3］。由于起病隐匿，大部分HCC患者直到中晚期才确诊。尽管HCC发生、发展中众多基因和信号通路已被广泛研究，但HCC潜在的分子机制尚未完全阐明。因此寻找HCC患者前瞻性的药物治疗靶点并预测HCC患者的预后具有重要意义。

细胞因子信号抑制物（suppressor of cytokine signaling，SOCS）蛋白家族成员在细胞因子信号传导调节中起关键作用［4］。SOCS家族成员的异常表达可促进疾病的发生和进展［5］。SOCS家族包括8个结构相关基因，SOCS1～7和CISH［6］。SOCS家族与各种类型肿瘤之间关系密切［7］。越来越多的研究表明，SOCS蛋白参与HCC的进展［8］，这可能有助于寻找HCC的治疗靶点。

本研究应用高通量数据库平台系统分析了SOCS在HCC中表达、临床病理特征、预后、生物学功能和潜在功能，为研究并验证SOCS家族成员在HCC中作用机制提供新的思路。

1.1 SOCS家族在HCC中的表达分析

Onconine（https：//www.oncomine.org/）包含一个常见癌症类型的微阵列数据库和一个基于网络的数据挖掘平台，该数据库旨在促进全肿瘤基因组表达的分析［9］。在最新的Oncomine版本中包含715个数据集和86 733个样本。本研究采用Student"st检验分析癌症标本与正常对照之间SOCS基因家族的转录水平。检索阈值设定为：P＜0.05，FOLD CHANGE=ALL，GENE RANK Top 10%。

1.2 SOCS家族基因表达

UALCAN（http：//ath.uab.ualcan.pedu）是基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库平台中31种常见肿瘤的RNA-seq数据和临床数据的交互式网络资源。UALCAN数据可以查询31种常见肿瘤类型和正常样本中基因的相对表达量，以及其他临床病理特征，如癌症分期、分级、种族、体质量、性别、年龄等［10］。在本研究中，UNLCAN被用来比较HCC和正常肝组织中SOCSs的转录表达水平。此外，还探讨了癌症分期和分级。Student"st检验用于分析癌症标本和正常对照之间SOCS基因家族的转录水平。检验水准α=0.05。

1.3 SOCS家族基因表达对HCC预后价值分析

Kaplan-Meier Plotter（http：//www.kmplot.com）是一种在线分析工具，可提供基因表达谱以及多种癌症患者的生存信息［11-12］。在本研究中根据SOCS家族在HCC表达的中位数，将HCC患者分为低、高表达组，并分别绘制SOCS家族K-M生存曲线，分析SOCS家族在HCC中的预后的价值，主要评估HCC患者的总生存期（overall survival，OS）。检验水准α=0.05。

1.4 SOCS家族蛋白表达分析

Human Protein Atlas（http：//www.proteinatlas.org/）是一个公共数据库，允许免费访问以探索人类蛋白质组。Human Protein Atlas数据库中包含44种正常人体组织类型的组织微阵列的免疫组织化学图片和来自近8 000名患者的17种主要人类癌症类型的表达数据［13］。本研究仅利用Human Protein Atlas判断SOCSs在正常和病理性HCC样品中的免疫组化染色结果。SOCSs蛋白表达基于染色强度和表达量，并展示典型表达图片［14］。

1.5 SOCS基因突变情况及在HCC患者中与SOCS家族共表达基因

cBioPortal（http：//www.cbioportal.org）是一个开放网络资源，用于可视化和分析多维癌症基因组学数据集［15］。在本研究中cBioPortal用于访问HCC（TCGA，临时）数据集，该数据集包含371个患者的临床病例数据，该数据集被用来探索SOCS家族基因改变频率、SOCS家族相关性分析、50个SOCS家族最常改变基因。String在线网站（https：//stringdb.org）用于构建蛋白与蛋白之间相互作用网络［16］。Cytoscape用来构建蛋白质与蛋白质相互作用网络中核心蛋白［17］。本研究利用经过String网站构建SOCS家族及相关蛋白与蛋白相互作用网络，结果放入Cytoscape软件中构建SOCS家族相互作用蛋白在HCC相关蛋白的核心蛋白。

1.6 SOCS家族成员及其共表达基因GO、KEGG信号通路富集分析

DAVID在线网站（https：//david.ncifcrf.gov/）是一个在线生物信息学工具，可鉴定大量基因或蛋白质的功能［18］。在本研究中利用DAVID进行SOCS家族基因相互作用蛋白的基因本体（gene ontology，GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO富集分析包括分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）、参与的生物过程（biological process，BP）。

1.7 统计学方法

HCC与正常肝组织中SOCS家族基因表达差异采用t检验，Oncomine、UALCAN、cBioPortal、Kaplan-Meier plotter数据库中数据的处理采用系统自带的在线软件进行分析。检验水准α=0.05。

2.1 Oncomine数据库中SOCS家族分子在HCC中的表达

通过Oncomine数据库对SOCS基因家族在HCC中的mRNA表达进行分析，SOCS家族大部分成员在HCC中存在差异表达（P＜0.05），见图1。SOCS2 mRNA在HCC组织中表达下降，下调倍数为-3.686、-4.266、-5.57，分别发表于Roessler Liver 2数据集［19］、Roessler Liver数据集［19］、Wurmbach Liver数据集［20］。SOCS3 mRNA在HCC中表达-3.693倍，见于Chen Liver数据集［21］。SOCS5 mRNA在HCC组织中表达上调，改变倍数为1.97、1.437、1.693，分别发表于Roessler Liver 2数据集［19］、Chen Liver数据集［21］、Roessler Liver数据集［18］。SOCS6 mRNA在HCC中表达下调-1.824倍，见于数据集Wurmbach Liver［20］。SOCS7 mRNA在HCC中 表 达上 调1.958倍，见 于Wurmbach Liver数据 集［20］。CISH mRNA在HCC组织中表达下降，下调倍数为-1.729、-2.259、-1.941、-1.752，分别发表于Mas Liver［22］、Roessler Liver［19］、Chen Liver［21］、Roessler Liver 2［19］。

2.2 UNLCAN数据库中SOCS家族分子验证

UNLCAN进一步测量了8个SOCS家族成员的mRNA表达水平，与正常肝脏组织样本相比，SOCS2、SOCS3、SOCS6、CISH表 达 量 下 降（P＜0.05），SOCS4、SOCS5、SOCS7表 达 量 上 调（P＜0.05），SOCS1表达量差异无统计学意义，如表1所示。UNLCAN数据库中SOCS家族成员在HCC表达差异与Oncomine数据库中结果基本一致，仅有SOCS4结果存在不同。

表1 Ualcan数据库中SOCS家族分子验证

2.3 HCC中SOCS蛋白质表达

通过Human Protein Atlas验证HCC中SOCSs蛋白质的表达模式。选取Human Protein Atlas中SOCSs蛋白的典型表达图片，如图2所示，SOCSs大部分成员在正常肝组织中不表达或低表达，而在HCC组织中观察到中等表达或不表达，部分SOCSs蛋白表达存在和转录水平不一致。

图2 Human Protein Atlas验证HCC组织和正常肝组织中不同SOCS的代表性免疫组织化学图像

2.4 Kaplan-Meier plotter数据库 中SOCS mRNA表达水平与肝细胞癌的预后分析

HCC患者中高表达的SOCS1（P=0.015）、SOCS2（P＜0.001）、SOCS8（P=0.001）mRNA与较长的OS相关（图4A、4B、和4H）；
HCC组织中高表达的SOCS4（P＜0.05）、SOCS5（P＜0.001）、SOCS7（P＜0.05）mRNA与较短的OS相关；
SOCS3（P＞0.05）、SOCS6（P＞0.05）mRNA与OS没有显著相关性。见图3。

图3 SOCS基因家族的表达与HCC患者OS的相关性

2.5 SOCS家族成员在HCC患者中突变及共表达基因

SOCS家族突变结果显示，在360例HCC患者中，共有133例（37%）患者存在SOCS家族基因改变，其中SOCS3基因突变率最高（11%），SOCS7基因突变率次之（9%），SOCS5基因突变率为7%，SOCS2、SOCS4、SOCS6基因突变率为6%，SOCS1基因突变率为3%（图4A）。采用cBioPortal在线工具计算SOCS家族之间的相关性，并进行Pearson校正，结果显示多个SOCS家族成员存在相关性（P＜0.05），见图4B。本研究构建了SOCS各家族成员50个最常改变的相互作用邻近基因，用维恩图构建各家族成员共表达基因，去除共表达重合部分，共有384个临近基因。用String在线网站构建SOCS家族基因及384个临近基因（图4C）。采用Cytoscape软件插件cytohubba构建384个临近基因中的核心基因，发现CCNB1、PLK1、CDC20、KIF20A、HJURP、CDCA3、GTSE1、MYBL2、IL6、PTGS2与SOCS家族之间改变密切相关（图4D）。

图4 HCC中SOCS家族成员的遗传相关性和突变

2.6 SOCS家族成员和共表达基因在HCC中的富集分析

DAVID分析显示，BP主要富集在Stat3蛋白酪氨酸磷酸化的正调控、胚胎胎盘发育、蛋白质泛素化、JAK-STAT级联、炎症反应（图5A），CC主要富集在细胞-基质连接、转录因子复合物、免疫突触、中心粒、膜（图5B），MF主要富集在细胞因子受体活性、组蛋白脱乙酰酶结合、转录因子活性/转录因子结合、组蛋白乙酰转移酶结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（图5C），KEGG通路主要富集在Jak-STAT、催乳素、肿瘤坏死因子、HTLV-1感染、FoxO相关的信号通路（图5D）。

图5 HCC患者中SOCS家族成员及其最相关基因功能预测和途径分析

SOCS蛋白通常被认为是JAK-STAT信号通路的拮抗剂和其他信号通路的调节剂。然而，SOCS和HCC相关研究较少，SOCS蛋白在HCC中的具体功能尚不确定。在本研究中，利用公开数据库综合分析SOCS家族在HCC中转录、预后价值、生存分析及可能的潜在功能。

HCC组织与癌旁组织相比SOCS1 mRNA在HCC中低表达，组织微列阵也显示SOCS1在HCC中低表达。体外实验证明，SOCS1在多种HCC细胞系中低表达，并且检测了SOCS1在HCC中不同程度的甲基化［23］。SOCS1和SOCS3在肿瘤中是重要的参与者，缺乏SOCS1和SOCS3的小鼠对二乙基亚硝酸铵诱 导 的HCC易 感［24］。本研究利 用UNLCAN、Human Protein Atlas分析，结果显示SOCS1在HCC组织和正常组织中表达差异无统计学意义，但K-M生存分析显示，患者SOCS1高表达有更长的OS。

SOCS2 mRNA和蛋白水平在HCC组织低于癌旁组织，低表达的SOCS2有更短的OS［25］。在本研究中oncomine数据库中多个数据集显示HCC中SOCS2 mRNA低表达［19-20］，UNLCAN平台中也显示SOCS2在HCC组织中低表达，患者SOCS2低表达有更短的OS，与上述研究结果基本一致。

SOCS3在HCC中表达低于癌旁组织，HCC中SOCS的低表达与较短OS显著相关，SOCS3表达水平是OS的独立危险因素［26-27］。在本研究中，Oncomine、UNLCAN、Human Protein Atlas都 显 示SOCS3在HCC中低表达，与上述研究结果基本一致，SOCS3表达水平与OS不相关，与上述研究结果不一致，有待进一步研究。

目前关于SOCS4与HCC发生、发展关系及临床病理特征相关研究较少。在本研究中，UNLCAN、Human Protein Atlas中显示SOCS4在HCC组织中高表达，HCC组织中高表达SOCS4与较差的预后显著相关。

Zhang等［28］研究显示，SOCS5在HCC组织中高表达，SOCS5高表达组OS和DFS明显低于低表达组，高表达的SOCS5是HCC预后的独立危险因素。在本研究中多个高通量数据库表明，SOCS5在HCC组织表达高于正常肝脏组织，SOCS5高表达组与低表达组相比有更短的OS，与上述研究结果基本一致。

本研究显示，与正常组织相比，SOCS6在HCC组织中低表达，低表达的HCC患者有更短OS和DFS［25］。

目前少有关于SOCS7与HCC发生、发展关系及临床病理特征的相关研究，本研究中多个数据库综合分析显示，SOCS7 mRNA在HCC组织中高表达，高表达的SOCS7倾向于更短的OS，而在HPA数据库中存在部分SOCS7蛋白高表达样本。

Oncomine中有多个数据集显示CISH在HCC中低表达［19，21-22］，UNLCAN中也显示CISH在HCC组织中低表达，低表达CISH的患者有更短的OS。

本研究应用多个高通量数据库评估SOCS家族在HCC中潜在的作用机制，从大数据角度探究SOCS家族在HCC组织中的表达、预后价值、潜在作用机制。本研究还存在一些局限性，首先，虽然SOCS1、SOCS2、CISH高表达的患者有更长的OS，SOCS4、SOCS5、SOCS7高表达mRNA的患者有更短OS，分析的所有数据均来自在线数据库，进一步的研究应包括更大的样本量来验证并探索SOCS成员在HCC治疗中的作用；
其次，本研究没有评估SOCSs在HCC中的潜在诊断和治疗作用，因此需要进一步研究，探索SOCSs是否可以用作诊断标志物或治疗靶点。