十二指肠黏膜微生态与乙肝相关慢加急性肝衰竭的相关性的研究进展

李世炼,郑少琴,汤影子,刘慧敏,毛 青

李世炼,郑少琴,汤影子,刘慧敏,毛青,陆军军医大学西南医院全军感染病研究所,重庆市感染病研究重点实验室 重庆市 400038

据世界卫生组织统计,全世界仍有超过2.6亿人存在慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染(占全球人口的3%以上),是很重大的公共卫生威胁,因此世界卫生组织(World Health Organization,WHO)提出“2030年消除病毒性肝炎行动计划”.同时我国仍有约7000万慢性HBV感染者[1],仅2019年乙型肝炎发病人数就高达1002292例.我国2018版《肝衰竭诊治指南》指出[2]: 慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)是在慢性肝病基础上发生的急性肝损伤,导致急剧且进行性加重的肝衰竭,且会导致短期内死亡.ACLF根据不同慢性肝病基础分为A、B、C三种类型.HBV相关的ACLF中A型较多见[3].有数据显示,ACLF 28 d死亡率为33%,90 d死亡率高达近50%[4].ACLF发生后,患者病情危重,死亡率高.因此临床早期干预,阻止其发生、发展极其重要.肠道微生态通过微生物-肠-肝轴循环,与HBV-ACLF的发生、发展密切相关[2]十二指肠作为肠道的开端及在肠道胆汁酸代谢的第一站,其黏膜菌群对HBV-ACLF肠道微生态的影响具有特殊的意义.

肠道菌群是机体最大的微生态系统,约有1014个细菌寄居于肠道内.包括30属500余种,主要由厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌构成,亦可根据其功能大致可以分为3类,即有益菌、有害菌和中性菌.其中以乳酸杆菌和双歧杆菌等对人体有益的专性厌氧菌为主,占肠道菌群总量95%以上[5].而酵母菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌为致病菌,另外大肠埃希菌、肠球菌等为条件致病菌.肠道菌群与机体处于动态平衡并维护着机体健康,当平衡打破时,常表现为有益菌减少、致病菌过度生长、条件致病菌转为致病菌,促使疾病进展.人类肠道微生物组已成为人类健康和疾病的主要因素之一.它携带着人体中最大的遗传物质库,甚至比人类基因组还要大.除了具有代谢活性,还与宿主的免疫防御密切相关[6].在健康状况下,通过宿主的免疫系统、胆汁酸的分泌和上皮内免疫细胞释放的抗菌肽,来精确调节肠道微生物的负荷、分布、组成和活性[7].HBV-ACLF的发生机制是细胞因子、炎症介质的增加,启动机体相关免疫反应,形成“炎症风暴”所致[2].HBV-ACLF发生时,交感神经过度活跃,胃肠蠕动降低,初级胆汁酸分泌降低,抗菌肽释放降低,使得微生物组发生改变.从而减少法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)、G蛋白偶联胆汁酸受体1(takeda G protein-coupled receptor 5,TGR5)等信号转导途径,引起肠道炎症,导致肠道上皮屏障的破坏,增加血脑屏障的通透性.微生物或其代谢物向门静脉血液循环的转运增加,移位的细菌遇到循环免疫细胞,导致树突状细胞活性受损,表达肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和γ干扰素(interferon γ,IFNγ)的淋巴细胞膨胀以及产生白细胞介素-17(interleukin 17,IL-17)的T辅助细胞耗竭,发生内毒素血症[8].由于穿过肠道上皮屏障的微生物触发了免疫反应,因此启动了慢性全身性炎症,从而推进病情发展.但也有研究认为针对C型HBV-ACLF,肠道微生态的改变是导致“炎症风暴”发生的前驱因素[9-11].肠道菌群失调和慢性肝病进展至ACLF的因果关系仍值得进一步探索研究.

近年来,大量研究通过分析粪便菌群证明ACLF的发生与微生物-肠-肝轴之间的相互作用有关.一项244例患者的研究结果显示: 用16S rRNA扩增测序对粪便的分析,发现肝硬化及ACLF患者的益生菌家族(包括Ruminococcaceae和Lachnospiraceae)与其他致病菌家族(包括Enterobacteriaceae和Bacteroidoidaceae)的比例失衡[12].病情进展程度,与菌族丰度的下降一致.此研究认为肝硬化患者的肠道微生物组会发生变化,而肠道病菌比例可能是评估病情进展有参考价值的定量指标.另一项129例患者的研究结果显示: 粪便Lachnospiraceae的减少是ACLF的特征,而Pasteurellaceae的相对丰富度可预测死亡率[13].其他,粪便16S rRNA基因扩增子的研究,证明特定的微生物组特征可以区分肝硬化和健康对照[14-17],并且微生物组的变化可能能够监测疾病的严重程度和进展,如肝硬化的进展、肝外器官的衰竭、ACLF和死亡.有研究证实: 肠道微生态改变与ACLF常见并发症有关[18],如肝性脑病、自发性细菌性腹膜炎等.另一研究,入组45例肝移植患者[19],移植术后患者粪便益生菌(Lachnospiraceae)增多,而致病菌(Enterobacteriaceae)减少.此研究虽未证明肠道微生物对肝脏的影响,但证实了肝脏对肠道微生物组有一定的影响.不过粪便微生态并不能完全代表整个肠道微生态.

迄今为止,大多数研究都是以粪菌分析来研究肠道微生态,但事实上粪菌微生态并不能完全代表肠道微生态.已有研究证明[20,21],粪便微生物群和结肠黏膜相关微生物群是不同的,而且十二指肠、空肠、回肠的黏膜与抽吸内容物的相关生物群亦有区别.近年来,小肠微生物群的组成与健康和胃肠疾病的关系日益受到重视.小肠菌群的特点是腔内小肠液流动和分泌部分肠道内抗菌肽[22],导致小肠菌群较低的密度(102-107/g).活检样本是目前人类研究黏膜菌群的金标准.2009年Kerckhoffs等人[23]的研究中,用十二指肠黏膜刷取样,通过荧光定量PCR的方法,发现肠易激综合征的患者双链双歧杆菌(Bifidobacterium)水平低于健康者,而高水平的铜绿假单胞(Pseudomonas aeruginosa)易激综合征的患者小肠中的糖蛋白水平显著高于健康人.2020年瞿国强等人的研究中[24],通过胃镜下钳取15例健康体检者的十二指肠球部黏膜,使用16S rRNA测序法进行生物信息分析.发现球部黏膜菌群测得个28个门,397个属,以梭杆菌门、变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门为主要菌群,而属水平球部黏膜以鲸甘菌属、气单胞菌属、贪铜菌属、不动杆菌属、梭菌属为主要菌群.2020年Maccioni等人[20]的研究中,针对106例酒精性肝病患者小肠黏膜与粪便相关的临床实验,认为肠道微生物移位的增加,与十二指肠肠道黏膜营养不良有关,与黏膜通透性增加没有关联.但肠道通透性增加可能与粪便微生物失调有关.2022年广州中医药大学的研究中[25],通过胃镜下钳取20例伴有纳差、嗳气、睡眠障碍的功能性消化不良患者和5例健康人的十二指肠黏膜,同时用细胞刷提取十二指肠降肠内容物,通过16S rDNA基因测序研究了十二指肠上的微生物组.采用LEfSe、FAPROTAX、SPSS等软件对十二指肠菌群的差异进行分析比较.发现功能性消化不良患者与健康组的十二指肠黏膜菌群存在显著差异,认为十二指肠微生态紊乱可能是导致功能性消化不良的主要原因.由于解剖学的特点,小肠部位的微生物样本收集很具挑战性,目前对小肠分布的菌群的了解所知甚少.小肠可能为ACLF患者肠道微生态的研究提供了新的切入点.

4.1 肠道的开端 口腔是细菌进入人体的首要通道.细菌伴随食物,由“口腔-食道-胃-十二指肠-空肠-回肠-结肠”的消化道路径进入到肠道.肠道微生态可能与口腔菌群侵入有关.HBV-ACLF发生时,患者消化道症状重,食欲下降,进食减少.有研究认为[18],食量或饮食结构的改变,会导致粪便菌落丰度的改变.进食减少,肠道益生菌的丰度减少,致病菌的丰度增加.有研究发现[26],口腔菌群会出现在肝硬化患者的粪便中.最近对肝硬化患者和正常人的唾液菌群差异研究中发现,在先前发生过肝性脑病患者中,口腔原籍菌毛螺杆菌科和瘤胃球菌科丰度显著减少,而普雷沃氏菌科和梭杆菌科丰度显著增加[27].小肠吸收食物90%的能量供应身体机能,对免疫、代谢和内分泌功能有着深远的影响.十二指肠作为小肠的开始端,可能对肠道菌群改变起着决定性作用.十二指肠黏膜微生态对HBV-ACLF患者的早期干预性治疗,具有临床研究意义.探索十二指肠肠道黏膜菌群组成份和代谢产物,对宿主病情进展的影响机制,为HBVACLF临床治疗可能提供参考,如益生菌、益生元等相关疗法、关注饮食、微生物移植等.

4.2 胆汁酸代谢在肠道的第一站 HBV-ACLF进展过程中,胆汁分泌减少及成分异常导致内毒素增加.白蛋白合成减少导致肠黏膜淤血水肿、肠道黏膜微结构破坏.库普弗细胞吞噬功能和T淋巴细胞功能下降导致机体抗感染清除外来病原体能力下降.这些都会引起非优势菌群免疫功能和清除能力下降,定植菌黏附定值能力减弱,从而影响肠道微环境,导致肠道黏膜菌群失调[28].肠道菌群移位、内毒素血症等引起ACLF加重及其他并发症,是患者死亡的直接原因.一项在小肠和大肠中培养等量的大肠杆菌的研究发现,小肠是细菌移位的主要部位[27].胆汁酸代谢途径是通过“肠-肝”循环,肠道微生态与“肠-肝”循环密切相关,十二指肠作为胆汁酸至肠道的第一站,可为肠道微生态影响HBV-ACLF宿主胆汁酸代谢、免疫功能相关的机制奠定研究基础.十二指肠黏膜微生物组成分及其代谢产物,对宿主胆汁酸代谢及相关通路的影响机制,有待更深入的研究.

肠道菌群失调与慢性肝病进展至ACLF有关,但因果尚不明确[29].有学者发现,肝衰竭患者存在肠道微生态失衡,益生菌减少,肠道有害菌增加[30],而应用肠道微生态制剂可改善肝衰竭患者预后.粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)作为一种新的治疗方法,对顽固性肥胖、顽固性便秘、伪膜性肠炎、炎症性肠病等难治性消化系统疾病治疗有显著疗效[31-35].同时,对肝衰竭尤其是肝性脑病的治疗可能优于单用益生菌[36],可进一步研究.但近年FMT的安全问题受到质疑,需进一步优化方案.

肠道菌群失调和慢性肝病进展至ACLF的因果关系尚不明确.粪便微生态研究不能完全替代整个肠道微生态研究.肠道微生态可能与口腔菌群侵入有关,十二指肠作为小肠的开始端,其黏膜微生态的改变可能先于粪便.“肠-肝-微生态”轴与HBV-ACLF的发生密切相关,HBV-ACLF的肠道微生态仍有许多未解之谜,十二指肠粘膜可作为研究突破口.HBV-ACLF患者十二指肠黏膜微生态改变与粪便微生态变化存在哪些成分差异,能否发现特定的复合益生菌来优化HBV-ACLF治疗方案,取代FMT,增加临床安全性？根据HBV-ACLF的病程特点寻找益生菌、益生元的最佳治疗时机,能否降低HBVACLF的发病率或死亡率？通过分析HBV-ACLF患者十二指肠黏膜的菌群-菌群、菌群-宿主之间的关系寻找影响因素,能否建立相关预警模型,量化致病菌的相关指标,指导临床抗生素的使用时机？