C-端嵌合PRRSV,T细胞抗原表位对PCV2,VLPs稳定性的影响

刘项羽，聂庆庆，杜恩岐

(西北农林科技大学 动物医学院,陕西 杨凌 712100)

PCV2开放阅读框2(ORF2)编码的Cap蛋白(约30 ku)形成的病毒样颗粒(VLPs)与完整的PCV2病毒粒子相似，是PCV2疫苗研制的理想靶标[3]。PCV2亚单位疫苗是利用杆状病毒表达系统、酵母表达系统或大肠杆菌表达系统等高效表达PCV2 Cap蛋白，然后对Cap蛋白进行提取、纯化、灭活，再与适宜佐剂乳化后制备而成。由VLPs制备的疫苗免疫原性良好[4-6]，可诱导猪产生免疫保护反应，对PCV2病毒产生完全保护[7-8]。VLPs具有很多独特的性质，如能够进行自我装配；
允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs,并将外源性抗原表位展示在其表面，可以作为疫苗呈递工具，能有效地将表位或基因呈递给靶细胞，因此在疫苗研究中受到广泛关注。外源基因的大小以及展示位点可影响VLPs的形成。Khayat等[9]深入分析了Cap单体以及VLPs的结构，结果发现Cap蛋白N末端在结构内部，而C末端暴露在结构外部。研究表明，在Cap蛋白的C-端插入相应外源细胞表位,能够同时诱导机体产生针对Cap和外源细胞表位的免疫反应，且不影响VLPs的形成[10]，但目前关于Cap蛋白C末端展示外源基因后对VLPs稳定性的影响研究尚比较少。为此，本研究采用分子生物学方法合成cap基因及其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4和cap-T5基因，构建其重组菌并进行诱导表达，对表达产物的热稳定性及VIPs的免疫效果进行检测，以期为开发稳定、免疫效果良好的PCV2 VLPs疫苗提供依据。

1.1 材 料

pET28a、ClearColiTMBL21(DE3)，由西北农林科技大学新兽药研究团队保存。质粒提取试剂盒，购自NEB；
TIGEN基因组提取试剂盒、primeSTAR max premix，购自TaKaRa；
DNA Marker、限制性内切酶，购自大连宝生物工程有限公司；
IPTG，购自Genview公司；
蛋白Marker，购自Therma公司；
琼脂糖，购自国药集团；
Elisa检测试剂盒，购自韩国金诺；
冷冻透射电镜，来自中国科学院武汉病毒研究所；
SDA25和SQ佐剂，购自赛德奥生物科技有限公司；
S350佐剂，购自桑米特生物科技有限公司。

1.2 cap及其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位基因的合成

从GenBank中获取1株PCV2b型毒株(ZJ株)的cap基因，对其密码子进行优化。同时，在cap基因C-端分别引入经筛选的PRRSV T细胞抗原表位T1(SSSHLQLIY)、T2(LLDTKGKLY)、T3(KVDVGGHLI)、T4(RRYVLSSIY-AV)和T5(FLDTV-GLITVSTAGYYHRR)，对其密码子进行优化，构建cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4和cap-T5基因，将构建的基因送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重组菌株的构建

根据上述合成的基因序列，利用DNAstar软件设计扩增cap、cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4、cap-T5基因的引物F、R、F/R-T1、F/R-T2、F/R-T3、F/R-T4、F/R-T5，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物及其序列详见表1。

表1 试验用引物及其序列信息Table 1 Primer sequence information

利用上述引物对合成的cap基因序列进行PCR扩增，PCR反应体系(20 μL)为：Taq预混酶10 μL，引物F、R(0.5 μmol/L)各0.5 μL，合成的cap基因模板(约200 ng/μL)0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；
72 ℃延伸5 min。以相同的PCR反应体系和扩增条件，分别用引物F/R-T1、F/R-T2、F/R-T3、F/R-T4和F/R-T5扩增基因cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4和cap-T5。用1%琼脂糖凝胶对所有基因的扩增产物进行电泳检测，用胶回收试剂盒回收目的基因条带。

分别将回收到的目的基因cap、cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4、cap-T5及载体pET28a,用NcoⅠ/Hind Ⅲ双酶切，酶切体系(20 μL)为：目的基因10 μL，限制性内切酶NcoⅠ 1 μL，限制性内切酶Hind Ⅲ 1 μL，缓冲液2 μL，ddH2O 6 μL，37 ℃反应3.5 h，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，用胶回收试剂盒回收目的基因条带及pET28a载体条带。将回收到的目的基因与pET28a载体连接(连接体系为10 μL：pET28a 1 μL，目的基因4 μL，连接酶混合液solution Ⅰ 5 μL)，16 ℃连接2 h，通过42 ℃热击法转化ClearColiTMBL21(DE3)感受态细胞(制备参照常规大肠杆菌感受态细胞制备方法)，用涂布含卡那霉素抗性(终质量浓度50 μg/mL)的LB平板进行筛选，挑取单克隆进行PCR验证和测序验证。将测序正确的菌株分别命名为重组菌pET28a-cap/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T1/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T2/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T3/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T4/ClearColiTMBL21(DE3)和pET28a-cap-T5/ClearColiTMBL21(DE3)，并进行菌种保藏。

1.4 重组蛋白的诱导表达

挑取上述6株单克隆菌，分别接种于含卡那霉素(终质量浓度50 μg/mL)的LB液体培养基中，34 ℃培养过夜，按照体积分数2%的接种量转接至发酵培养基(其中含有酵母提取物20 g/L，胰蛋白胨10 g/L，硫酸铵20 mmol/L，硫酸镁6 mmol/L，PB 50 mmol/L，甘油10 g/L，调pH为7.2)中，37 ℃ 220 r/min培养至菌液在600 nm处吸光度(OD600)为0.6左右时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，于28 ℃诱导培养9 h。取诱导培养液，12 000 r/min离心5 min，收集重组菌体，按照1 g菌体加9 mL PBS缓冲液(pH 7.2)的比例制备菌悬液，于ATS均质机中进行细胞破碎(压力为80 000 kPa，破碎2遍)，收集细胞破碎液。

分别取上述6种细胞破碎液200 μL于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min，取上清200 μL，加入5×蛋白上样缓冲液50 μL；
沉淀加入200 μL PBS缓冲液(pH 7.2)重悬，混匀后同样加入5×蛋白上样缓冲液50 μL。将上清和沉淀液蛋白均置于100 ℃水浴中处理3 min，12 000 r/min离心5 min，取上清10 μL进行SDS-PAGE蛋白电泳验证。

基于“调整结构、补齐短板、提升质量”，推进供给侧改革，以精准扶贫为核心，“输血”与“造血”相结合，从目标层、战略层和路径层提出供给侧改革视角下精准扶贫优化路径，对接扶贫资源供需，确保贫困地区精准脱贫，见图4。

1.5 热处理对PCV2 Cap VLPs样品稳定性的影响

分别取上述细胞破碎液500 μL于1.5 mL EP管中，置60 ℃水浴锅中处理30 min，取样，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃处理3 min。对照为未经过热处理的细胞破碎液上清。离心后取样进行SDS-PAGE检测。

对热处理后的细胞破碎液上清进行抗体-抗原琼脂糖平板扩散验证试验。将热处理后的细胞破碎液上清样品于“V”型板上做2，4，8，16，32，64，128，256倍稀释，在制备好的琼脂糖扩散平板(直径4 mm的梅花形打孔器打孔，中间孔与外周孔距离为3 mm)6个周围孔中加入稀释好的样品60 μL/孔，在中间孔加入Cap阳性血清(60 μL)，将琼脂糖扩散平板放入湿盒，盖好盖放入37 ℃温箱中反应48～72 h后取出，琼脂糖扩散平板读数；
按照成线清晰及重复孔是否一致读数，判定效价。试验重复2次，对照为未经过热处理的细胞破碎液上清。

1.6 PCV2 VLPs颗粒的冷冻透射电镜观察

分别将pET28a-cap/ClearColiTMBL21(DE3)、 pET28a-cap-T4/ClearColiTMBL21(DE3)细胞破碎液60 ℃热处理30 min，取上清放置在碳包覆的铜网格上，用滤纸干燥，用质量分数2%磷钨酸负染，室温下放置24 h；
用透射电子显微镜(HT7700)在120 kV的加速电压下进行电镜观察，确定Cap蛋白是否组装成VLPs颗粒。

1.7 VLPs免疫效果检测

取20只小鼠，随机分为阳性对照(市场苗)、阴性对照(生理盐水)、VLPs+佐剂SQ、VLPs+佐剂S350和VLPs+佐剂SDA25等5个组，每组4只。由于C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位后导致VLPs不稳定，故小鼠试验未设计C-端融合外源基因的试验组。

免疫程序为：免疫1针，注射剂量100 μL/只(免疫剂量为20 μg/只)，阴性对照组注射等体积生理盐水代替疫苗。分别于免疫后7，14，21和28 d采血，使用PCV-2抗体检测试剂盒的Elisa定量抗体水平。

2.1 目的基因的PCR扩增

以合成的基因为模板进行PCR扩增，结果(图1)显示，目的条带单一清晰，cap、cap-T1、cap-T2、cap-T3、cap-T4和cap-T5基因大小分别为633，660，660，660，666和690 bp，均与预期扩增片段大小一致。

2.2 重组蛋白的诱导表达

将上述验证正确的重组菌株接种于发酵培养基中，诱导表达后收集菌体，细胞破碎后经SDS-PAGE蛋白电泳验证，结果见图2。

由图2可知，获得的Cap蛋白及Cap-T1、Cap-T2、Cap-T3、Cap-T4和Cap-T5嵌合蛋白大小正确，条带清晰，其分子质量约为26 ku，灰度分析显示60%以上的蛋白为可溶性表达。

2.3 热处理对PCV2 Cap VLPs样品稳定性的影响

2.3.1 SDS-PAGE试验 由图3可知，60 ℃处理不同时间对目的蛋白Cap含量几乎无影响，说明PCV2 Cap蛋白具有一定的热稳定性，这为后期利用原核系统规模化生产高质量的PCV2 VLPs疫苗奠定了基础。图4表明，60 ℃处理30 min时，Cap-T1、Cap-T2、Cap-T3、Cap-T4和Cap-T5嵌合蛋白大部分遭到损失。

2.3.2 血清抗体-抗原琼脂糖扩散试验 琼脂糖扩散试验结果显示，所有重组菌株细胞破碎液上清液琼脂糖扩散效价均为8，说明cap基因C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位具有可行性，结合前述SDS-PAGE结果可知，cap基因C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位并未影响Cap蛋白的表达量，但热处理(60 ℃ 30 min)后，pET28a-cap/ClearColiTMBL21(DE3) 细胞破碎液上清琼脂糖扩散效价未下降，而C端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的重组菌株细胞破碎液上清琼脂糖平板扩散效价均有大幅下降，其中pET28a-cap-T1/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T2/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T3/ClearColiTMBL21(DE3)琼脂糖扩散效价降为0，而pET28a-cap-T4/ClearColiTMBL21(DE3)、pET28a-cap-T5/ClearColiTMBL21(DE3)琼脂糖扩散效价降为2。

2.4 Cap蛋白的VLPs颗粒电镜观察

由图5电镜观察结果可以看出，在pET28a-cap/ClearColiTMBL21(DE3) 细胞破碎液60 ℃处理30 min后的上清液中，能够清晰地看到大量PCV2 VLPs的形成；
而在pET28a-cap-T4/ClearColiTMBL21(DE3)的细胞破碎液60 ℃热处理30 min后的上清中，依然能够观察到大量处于半解聚状态的VLPs颗粒，VLPs的不规则性明显增加。

2.5 VLPs的小鼠免疫效果评价

由图6可知，无论是市场苗，还是来源于原核VLPs的自配苗，免疫后21 d抗体均达到了较高水平，其中VLPs+佐剂SDA25组免疫效果与阳性对照效果相当，VLPs+佐剂S350组免疫效果较阳性对照效果更好。

目前，人们已经利用真核和原核表达系统成功制备出PCV2 Cap基因工程疫苗，如张家明[11]用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗，张永武等[12]采用bacPAK杆状病毒表达系统表达的PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗，梁翠琴[13]将Cap蛋白在Sf9细胞中进行表达并对其免疫原性进行了检测。目前，利用杆状病毒表达系统表达PCV2 Cap蛋白，其表达量已经能够提升到198 mg/L[14]，但限于培养时间及培养成本，由其生产的疫苗价格依然偏高。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、培养周期短、可以大规模发酵培养、产量高、成本低等优点，是现阶段规模化生产重组蛋白常用的表达系统。2005年，Shang等[15]最先采用大肠杆菌表达了信号肽定点突变的Cap蛋白，并通过PCV2阳性血清反应验证了其特异性，开启了原核表达制备亚单位疫苗的先河。杨莹莹等[16]利用原核表达系统获得了免疫原性良好的高纯度重组Cap蛋白；
另外，有研究者利用PCV2 Cap蛋白结合一系列融合标签(SUMO标签、His标签、谷胱甘肽转移酶GST等)进行共同表达，使Cap蛋白的免疫效果得到了明显提高[17]。

Beach等[18]成功地构建了在PCV2 Cap N-端和C-端插入标签的重组嵌合型病毒，其中插入到PCV2 Cap蛋白C-端的标签能够诱导猪同时产生抗Cap和抗标签蛋白的抗体，证明外源基因的插入并未影响PCV2重组病毒的繁殖，Cap蛋白C-端能够插入最少27个氨基酸，同时不影响VLPs的结构。Huang等[19]在PCV2a/CL株Cap蛋白C-端插入猴副流感病毒V5表位基因的重组PCV2，此重组病毒能够诱导小鼠产生抗Cap和V5标签的抗体。PCV2 Cap蛋白N-端的精氨酸残基可能参与绑定病毒的DNA[20]，位于病毒粒子的内部，C-端位于病毒粒子的表面[21-23]。已有文献报道，在Cap蛋白C-端串联表达其他外源基因后于杆状系统中进行表达, 纯化后的目的蛋白能够有效地与PCV2单克隆抗体发生特异性反应，并且可以在体外自组装形成均一的直径约17 nm的病毒样颗粒[24]；
Li等[25]将Cap蛋白C-端4个氨基酸残基替换成猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的抗原表位基因，利用原核表达系统进行Cap蛋白的表达，成功地检测到了VLPs。

本课题组在前期研究中，对VLPs组装工艺进行了优化，并发现经优化工艺组装的PCV2 Cap VLPs颗粒具有热稳定性[26]。本研究发现，在60 ℃条件下处理30 min以上,Cap蛋白依然保持稳定；
在此基础上以PCV2 Cap VLPs颗粒作为载体，在Cap蛋白的C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位，成功实现了Cap嵌合蛋白的大量可溶性表达，并观察到了VLPs颗粒，但C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的VLPs颗粒的热稳定性大幅下降，其中插入7个氨基酸(T1/T2/T3)时完全检测不到琼脂糖扩散效价，插入11及19个氨基酸(T4/T5)时，虽然能够检测到蛋白和琼脂糖扩散效价，但均大幅降低，可能的原因是C-端嵌合外源基因导致VLPs的结构发生了改变，T细胞表位呈疏水性，Cap蛋白的C-端暴露在外，为亲水性，C-端的亲水性一旦被疏水性的T细胞表位破坏，就有可能导致VLPs的组装及稳定性出现问题。由于Cap C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位会导致其生成的VLPs颗粒的稳定性发生改变，故本试验仅对Cap蛋白的免疫效果进行了验证，并对佐剂进行了初步筛选，结果发现，原核系统表达PCV2 Cap蛋白形成的VLPs能够诱导较好的特异性抗体，其中以VLPs+佐剂S350的效果最好。

以原核表达系统表达的PCV2 Cap形成的 VLPs颗粒疫苗，成本是杆状病毒表达系统表达的PCV2 Cap形成的VLPs疫苗的1/5左右，且疫苗生产周期缩短了3/4，工艺更为简单。该结果证明了利用原核表达系统进行PCV2 VLPs疫苗开发的可行性，同时进一步证明了Cap蛋白羧基端在维持VLPs颗粒稳定性，特别是热稳定性方面发挥着重要作用，为后期进一步改进VLPs颗粒、生产高质量且稳定的PCV2 VLPs疫苗奠定了基础。