肠道类器官在畜禽营养中的研究进展

王 丹 刘玉兰

(武汉轻工大学，动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，武汉 430023)

肠上皮是一个复杂的系统，其具有独特的结构和细胞特征，不仅参与营养物质的吸收，而且在机体免疫防御中也发挥着重要作用。以往肠道体外研究主要以2D培养的肠道上皮细胞系为模型，但这些细胞系不能充分反映肠道形态生理的相关性和肠道分化功能，且在培养过程中也易突变。随着肠道干细胞研究的发展，产生了一种新的研究模型，称为肠道类器官。肠道类器官不仅能还原肠道组织复杂的结构，也能模拟肠道的生理环境，是肠道研究比较精准的体外模型。肠道类器官由位于隐窝底部的肠道干细胞分化而来。肠道干细胞增殖产生过渡扩增(transit amplifying,TA)细胞，这些细胞由隐窝底部向绒毛顶端迁移并分化，形成成熟的完全分化的肠道功能细胞，构成了肠道的隐窝-绒毛结构[1]。肠道类器官的培养受多种信号通路的精准调控，例如Wnt、Notch和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等。目前，随着猪、鸡、牛和羊等畜禽肠道类器官培养技术的建立[2-6]，肠道类器官已应用于畜禽营养吸收评价、肠上皮发育以及肠道微生物等方面的研究。本文将综述肠道类器官在畜禽营养中的研究进展，旨在为畜禽饲料添加剂的开发、动物肠道疾病的治疗提供崭新的思路和方向。

1.1 肠道干细胞

肠道由单层上皮细胞组成，并具有典型的隐窝-绒毛结构。肠上皮通常3～4 d完成1次更新。这种快速更新使得肠道在复杂的环境中具有良好的屏障功能和自我保护能力。肠道干细胞是一种位于隐窝基底部，具有自我更新和分化为肠上皮功能细胞的成体干细胞。目前的研究认为，肠道干细胞存在2种类型：一种是位于隐窝基部的隐窝基部柱状(crypt base columnar，CBC)细胞，也称为活跃型肠道干细胞；
另一种是位于隐窝+4位置(隐窝基底部之上的第4层细胞)的干细胞，也称为沉默型肠道干细胞。2007年，有研究团队使用体内谱系追踪技术发现，CBC细胞特异性表达富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5(Lgr5)基因，并发现整个隐窝的各种成熟细胞(包括潘氏细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞)均来源于Lgr5细胞，首次证明隐窝底部的Lgr5+细胞为肠道干细胞[1]。CBC干细胞除分子标志物Lgr5外，还包括嗅质蛋白4(Olfm4)和Achaete-Scute家族BHLH转录因子(Ascl2)等，这类细胞具有增殖快速且对放射线敏感等特点[7]。沉默型肠道干细胞的分子标志物有Bmi1、仅有同源结构域的蛋白质同源框(Hopx)和小鼠端粒酶逆转录酶(m-Tert)等，这类细胞的特点是增殖缓慢且对放射线不敏感[7]。在正常生理条件下，CBC干细胞快速增殖为TA细胞并分化成各种肠道功能细胞来维持肠道自我更新和再生。当肠道受损时，Lgr5干细胞会大量的丢失，且无法满足肠上皮的快速修复，会进一步启动沉默型肠道干细胞的功能。沉默型肠道干细胞会转化为Lgr5干细胞或功能细胞的前体细胞(如潘氏细胞的前体)，进而分化为各种肠道功能细胞促进肠上皮再生[8]。

1.2 肠道类器官

肠道类器官由肠道干细胞增殖和分化而来，首先形成具有单个中央管腔的空心小球，随后向外突出形成具有隐窝状的萌芽结构。2009年，Sato等[9]首次分离了小鼠的单个Lgr5肠道干细胞，将其与基质胶混合形成3D骨架结构，并添加一些必需生长因子，如表皮生长因子(EGF)、Noggin(BMP通路抑制剂)、Wnt3a和R-spondin1(Wnt信号激活)，成功培养了具有球状3D结构的肠道类器官。肠道类器官包含单层肠上皮的所有细胞，球体的内部类似于肠腔，可容纳脱落的细胞和代谢产物。肠道类器官成熟后，可通过出芽的方式形成更多的类器官，可持续传代培养并保持遗传信息的稳定。与肠道组织类似，肠道类器官含有所有种类的肠上皮功能细胞，包括肠上皮吸收细胞、内分泌细胞、杯状细胞、潘氏细胞和簇细胞[9]。肠上皮中复杂的细胞种类决定了肠道的多种生理功能，如营养物质的消化吸收、激素的分泌、病原菌的抵御以及先天免疫反应等。

2.1 Wnt信号通路

肠道类器官的生长主要依赖于肠道干细胞的增殖和分化。Wnt信号是调节肠道类器官生长关键的信号通路之一，常与BMP、Notch等信号通路发生协同或拮抗的相互作用。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号能激活肠道干细胞中的Lgr5和Bmi1表达，并诱导干细胞增殖[10]。Wnt配体和膜上的卷曲受体蛋白(Frizzleds)以及共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(LRP5/6)结合后，会抑制大肠腺瘤息肉蛋白(APC)对β-catenin磷酸化引起的降解，β-catenin与核膜蛋白互作，进入细胞核与T细胞转录因子4(TCF4)结合，启动下游靶基因c-Myc和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)的转录，促进细胞增殖。研究表明，激活Wnt/β-catenin信号通路可以促进干细胞对称分裂和祖细胞去分化[11]。Wnt/β-catenin信号通路不仅调控Lgr5的表达，同时也受Lgr5的反馈调控[12]。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路只有在R-spondin存在的情况下才可能被激活，而肠道干细胞标志物Lgr5作为R-spondin的受体通过稳定结合β-catenin增强Wnt信号传导[13]。Lgr5在细胞膜上与Wnt受体LRP6和卷曲受体蛋白相互作用能增强Wnt/β-catenin信号通路[12]。因此，培养基中常添加Wnt信号通路的激活剂，如Wnt3a和R-spondin等生长因子来促进肠道类器官的扩增。

2.2 BMP信号通路

BMP参与肠道的发育和稳态的调节。BMP在肠上皮的绒毛区域中高度表达，但在隐窝底部表达量较低[14]。研究表明，BMP信号能够促进上皮细胞的分化，且抑制隐窝的生长[15]。此外，BMP也能抑制β-catenin的活性以及负调控肠道干细胞的增殖[15]。转基因表达Noggin能够抑制BMP信号，诱导绒毛中异位隐窝的形成，并伴随着肠道干细胞数量的增加[15]。条件性敲除BMP受体BMPr1a能够引起肠道干细胞的过度增殖和隐窝数量的增加[15]。BMP的配体BMP2和BMP4通过结合其Ⅱ型受体和募集Ⅰ型受体(Bmpr1a或Bmpr1b)，将信号通过SMAD转录因子从细胞质转导至细胞核。BMP能够防止一种抑癌基因同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)磷酸化失活，维持PTEN的活性。PTEN通过抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)，进而降低蛋白激酶B(Akt)的表达和β-catenin活性[15]。因此，培养基中常添加BMP拮抗剂Noggin以促进肠道类器官隐窝的形成[16]。

2.3 Notch信号通路

Notch信号通路对于控制肠道干细胞的分化至关重要[17]。当Notch受体和其配体Delta样配体1(Dll1)、Delta样配体4(Dll4)结合时，能够在γ-分泌酶(γ-secretase)的作用下释放出Notch胞内片段(NICD)，NICD转移到核内与转录因子CSL结合影响下游靶基因[Hes1和无调性同源蛋白1(Atoh1)]的表达，进而调控肠道干细胞的增殖和分化。多项研究表明，Notch信号通路能够控制肠道干细胞向分泌型细胞分化的命运[18]。Notch能够激活Hes1的表达进而抑制Math1基因转录，而Math1是肠道干细胞向分泌型细胞分化的调控者。Hes1缺失能够增加分泌型细胞，减少肠上皮细胞数量[19]；
而Math1的缺失将导致所有分泌型细胞的缺失[20]；
Math1过量表达引起小鼠肠绒毛变短、TA细胞减少，分泌型细胞增多以及肠细胞的缺失[21]。因此，激活Notch信号将会引起隐窝增殖细胞扩增，并抑制其向分泌型细胞分化。在类器官培养中常通过添加Notch信号的调节因子如丙戊酸、组蛋白去乙酰化酶抑制剂来维持干细胞的数量，促进其向成熟的肠上皮细胞分化。

2.4 Hippo信号通路

Hippo信号通路最初在果蝇中被认为是高度保守的信号。在哺乳动物中，机械刺激会导致核心Hippo通路的激活，其中丝氨酸/苏氨酸激酶MST1/2、SAV1、LATS1/2和MOBKL1A/1B参与激酶级联反应，最终导致转录共激活因子YAP和TAZ的磷酸化。YAP和TAZ的磷酸化会导致它们被排除在细胞核之外并无法调控基因的表达。相反，在没有Hippo通路信号传导下，去磷酸化形式的YAP和TAZ位于细胞核，并与TEAD转录因子协同作用并激活增殖相关基因的表达[22]。Hippo信号通路在肠道干细胞中的作用已被广泛的研究。过表达YAP1的活性形式能抑制肠细胞的增殖并伴随着Olfm4干细胞的丢失，而肠道上皮特异性敲除YAP1尽管不影响正常情况下的肠道功能，但在辐射损伤时会导致肠道过度生长和Lgr5+干细胞大量扩增[23]。相关研究表达，YAP1通过维持干细胞池参与早期肠道的再生，而晚期过度增殖与YAP和TAZ无关[24]。在肠道再生中，机械刺激调节Hippo通路可改变生态位和隐窝结构来调控肠道干细胞的生物学功能。

3.1 营养素吸收研究

肠道类器官模拟体外器官组织培养，能够精准反映畜禽动物体内营养素的吸收代谢特性。肠道类器官中的一些营养物质消化吸收的关键酶和基因与肠道组织具有高度的一致性。研究表明，吸收细胞的分子标志物[肠道碱性磷酸酶(ALPI)、角蛋白20(KRT20)]、消化酶(蔗糖酶-异麦芽糖酶)和离子/营养转运蛋白[单羧酸转运蛋白1(MCT1)、钠依赖型葡萄糖共转运蛋白1(SGLT1)和钠氢交换蛋白3(NHE3)]均在猪、兔、鸡和牛肠道类器官中表达[2-6,25-29]。在猪和鸡的肠道类器官中也能观察到成熟肠道组织的微绒毛[27,30]。此外，猪、兔和牛的肠道类器官中也表达内分泌细胞的标记基因酪酪肽(PYY)和嗜铬粒蛋白A(CHGA)，这些基因参与消化酶的分泌[27,29]。以往的研究常用2D单层细胞来评价营养素的吸收能力，即营养素从顶端转运到上皮细胞的基底外侧的过程[31]。最近，越来越多研究者采用肠道类器官来评价营养素对肠上皮稳态的影响。Hou等[32]采用精氨酸处理鸡肠道类器官后发现，精氨酸能通过维持肠道干细胞增殖和潘氏细胞数量来缓解炎性刺激引起的肠道类器官损伤。Zhu等[33]以猪的肠道类器官为模型探究了谷氨酸对肠上皮细胞自我更新的影响。Wang等[34]采用维生素A处理仔猪肠道类器官后发现，维生素A能减少分化细胞的出芽和标志基因的表达，同时增加干细胞标志物的表达。总之，以肠道类器官替代肠道细胞系为模型将会是未来营养学体外研究的重要方向。

3.2 病原菌与宿主互作研究

肠道类器官模型可用于模拟病原菌对肠道上皮的感染过程。借助肠道类器官，研究者可以深入剖析病原菌的入侵方式(在基底外侧或顶端)、细胞内复制和繁殖以及逃逸的分子机制。目前，已成功建立了多种病原体感染畜禽肠道类器官的模型。在猪的肠道类器官上，已成功建立了猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪三角冠状病毒(PDCoV)的感染模型[35-37]。在牛上，也成功建立了感染鼠伤寒沙门氏菌、刚地弓形虫和轮状病毒的肠道类器官模型[38]。这些感染模型可以完全替代试验动物，大大降低了动物的使用成本。采用类器官培养，研究者可以更进一步探究病原体的入侵机制，如病菌主要黏附于哪种肠上皮细胞类型或识别哪段肠道部位。例如，PEDV和PDCoV主要感染猪的肠上皮细胞、肠道干细胞和杯状细胞，在猪小肠的易感性要比结肠高[28]。另外，肠道类器官也可用于研究由肠道病原体引发的上皮细胞先天免疫反应，而用单一的肠道细胞系是无法实现的。

3.3 肠道微生物与上皮互作研究

肠道微生物在维持肠道上皮的消化吸收、屏障和防御功能中发挥着重要作用。肠道类器官作为一种精准的体外模型，已被广泛地研究肠道微生物与上皮细胞之间的互作关系。这方面的研究目前主要集中在小鼠和人，在畜禽动物中的研究较少。以小鼠肠道类器官为模型，Hou等[39]发现乳酸杆菌能保护肠道的屏障功能并激活肠道干细胞的增殖来促进肠道的损伤修复。在结肠类器官中通过显微注射能成功建立一个模拟人类复杂的肠道微生物群与结肠互作的模型[40]。Pierzchalska等[41]以鸡胚肠道类器官为模型，发现嗜酸乳杆菌能促进了鸡胚肠道上皮细胞的生长。最近一项研究以兔盲肠类器官为模型来探究断奶后肠道微生物死亡变化对肠道发育的影响，结果显示，从哺乳到断奶的过渡期肠道微生物代谢物的变化会调节上皮细胞中的基因表达，并有助于肠道屏障的成熟[42]。肠道微生物与类器官共培养体系的建立是微生物研究领域的重大突破。未来的研究需要进一步开发不同畜禽动物肠道类器官-微生物的共培养体系，以及多种肠道微生物与类器官共培养体系。

肠道类器官的培养技术的发展为畜禽动物的肠道研究提供了许多便利。经过多年的努力，目前已成功培养了多种畜禽动物的肠道类器官。尽管如此，这些畜禽动物的肠道类器官培养体系还不够完善，培养条件仍需要进一步优化。例如：1)目前类器官的3D培养主要依赖动物来源的基质胶，而这些基质胶成分复杂，批次稳定性不高，在质控上难以把控；
2)目前肠道类器官仅仅包含了肠上皮细胞，而不含有成纤维细胞、免疫细胞、血管细胞等基质细胞，这些特征与肠道组织的环境还存在一定的差异，在很大程度上限制其在其他领域的应用；
3)由于肠道类器官的生长存在一定的边缘效应，往往处于基质胶外围的类器官尺寸较大，而处于基质胶中间的尺寸偏小，导致肠道类器官的均一性较差，该一系列特点使得类器官的定量分析存在一定的难度。肠道类器官的共培养仅仅能反映营养素或微生物与肠道隐窝的互作，而体内的这些物质是直接与肠上皮细胞接触的。因此，类器官肠腔显微注射技术也许能更好地解决这一难点。目前，大多数畜禽动物肠道类器官仅仅是作为一种研究模型，未来可能在干细胞治疗、器官移植等方面具有一定的应用价值。