具有降血压功能乳酸菌的筛选及其益生作用

王雅丽，李雪龙，余 萍，闵祥博，矫艳平*，李东红

（1.江西仁仁健康产业有限公司，江西 樟树 331200；
2.远大生命科学（辽宁）有限公司，辽宁 沈阳 110171）

高血压是指以体循环动脉血压（收缩压和/或舒张压）增高为主要特征，伴或不伴心、脑、肾等器官功能或器质性损伤的心血管综合征[1-2]。目前临床中针对高血压患者多采用常规降血压药物进行治疗，但此类药物通常需长期应用才可见明显效果，且患者经长期用药后会面临较多的毒副作用与不良反应，因而探索相对安全、无副作用的治疗方式显得尤为重要。近年来，诸多研究表明，高血压和肠道菌群的失调具有直接关系，而且口服益生菌制品可通过改善肠道菌群进而明显降低血压[3]。此外，高血压的控制与多种代谢途径有关，而血管紧张素转换酶（angiotensin convertingenzyme，ACE）的调节是一个关键调控因素[4-5]。ACE是从人体组织和体液中发现的一种二肽羧肽酶，通过将血管紧张素I转化成血管紧张素Ⅱ来提高血压[6]，在人体心血管系统中起着至关重要的作用。

益生菌是一类对机体健康产生有益作用的活性微生物，可以调节肠道微生态的平衡以及肠道微生物的代谢活动[7-8]。研究表明，益生菌在发酵过程中通过其胞外蛋白酶、肽酶（羧肽酶、氨肽酶）的水解作用，将食物蛋白（如乳蛋白）中具有降压活性的肽片段释放出来，它们能与ACE活性中心结合，竞争性地抑制ACE活性，使血管紧张素Ⅰ不能转化为血管紧张素Ⅱ，并催化缓激肽水解成为失活片段，从而起到降血压的作用[9-10]。因此，具有降血压功能的益生菌筛选与研究成为人们日益关注的焦点。

本试验以体外ACE抑制率为考察指标，采用ACEKit-WST试剂盒[11-12]筛选ACE活性抑制能力较强的菌株，从而获得降血压功能菌株，并考察菌株的耐受性，以期为菌株的进一步应用提供研究基础。

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株

鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）HCS01-013：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.19510；
鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）（菌株编号HOD02-001、HEL07-034、HEX12-005）；
罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri）（菌株编号ARD-12、AOD-17、ADF-23）；
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）（菌株编号AMA-01、AME-03）；
瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）（菌株编号BDL-01、BHL-15、BFL-21）：本公司菌种库保存。

1.1.2 试剂

盐酸、氢氧化钠、胃蛋白酶（酶活≥3 000 U/g）：北京奥博星生物技术有限公司；
胰蛋白酶（酶活≥5 000 U/g）：国药集团化学试剂有限公司；
磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）：生工生物工程（上海）股份有限公司；
脱脂乳：飞鹤乳业有限公司；
ACEKit-WST试剂盒：日本同仁化学研究所。本研究所用试剂均为分析纯或生化试剂。

1.1.3 培养基

改良MRS培养基[13]：酵母蛋白胨12 g，牛肉粉4 g，酵母粉3 g，磷酸二氢钾2 g，乙酸钠3 g，葡萄糖25 g，七水合硫酸镁0.58 g，四水合硫酸锰0.25 g，吐温800.6 g，番茄汁10 mL，蒸馏水1 000 mL，调pH至6.2，115 ℃灭菌30 min；
固体培养基琼脂添加量2%。

1.2 仪器与设备

DHP-500BS恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器有限公司；
TGL-16M低温高速离心机：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；
PHS-25酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；
Multiskan FC酶标仪：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；
LDZX-50KBS高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；
DZKW-S-4恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；
JA2003N电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；
101-1ES电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂；
MDF-382E（CN）医用低温箱：松下冷链（大连）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

将保藏于-80 ℃冰箱的试验菌株取出，室温条件下解冻、混匀，取1环菌液于改良MRS固体培养基划线，37 ℃培养48 h；
选取菌落形态、大小一致的单菌落接种至5 mL改良MRS液体培养基中，37 ℃培养17 h；
将菌液全部接种至100 mL改良MRS液体培养基中继续37 ℃培养17 h，得到活化3代后的菌液，待用[14]。

将上述得到的3代菌液以3%的接种量，接种至质量分数为11%的脱脂乳中[15]，37 ℃培养20 h，测定pH，并调节至6.0±0.02。取适量培养物，于4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液，再次将pH调整至6.0±0.02；
取上清液1 mL，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取离心后的上清液为待测样品[16]。

1.3.2 ACE抑制率检测

本试验为筛选具有ACE抑制率高的菌株，采用ACEKit-WST试剂盒对12株供试菌株ACE的抑制率进行检测，按照表1添加量分别在酶标板中加入待测样品、去离子水、底物缓冲液和酶工作液，37 ℃反应1 h后，按照试剂盒说明书配制指示剂工作液，加入指示剂工作液，室温条件下（20～25 ℃）反应10 min（见表1），立即在波长450 nm处测定吸光度值[17]。

表1 各孔添加溶液的体积及反应条件Table 1 Volume and reaction conditions of solution addition in each well

1.3.3 模拟胃、肠液试验

取上述1.3.1制得的菌液振荡摇匀，取菌悬液10 mL离心（5 000×g、10 min、5 ℃）获得菌泥，用PBS冲洗3次，获得的菌泥重悬于10 mL模拟胃液中，37 ℃条件下消化3 h，分别于0 h、3 h取样，按照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中的方法进行菌落计数；
将传代三次的菌液振荡摇匀，取菌悬液10 mL离心（5 000×g、10 min、5 ℃）获得菌泥，用PBS冲洗3次，获得的菌泥重悬于10 mL的人工肠液中，37 ℃条件下培养，于0、2 h、4 h分别取样测活菌数[18-19]，计算菌株存活率。

1.3.4 耐酸试验

将传代3次的菌液按照10%的接种量分别接种于空白对照、pH2.0和pH3.0的基础MRS培养基中。37 ℃静置培养，于17 h取样，用灭菌的生理盐水进行一系列的10倍稀释，分别取适宜稀释度的菌液1 000 μL进行活菌计数，每个稀释度3次重复，37 ℃静置培养36～48 h后计数。

1.3.5 耐胆盐试验

将活化3次的菌液按照10%的接种量分别接种于空白对照及不同胆盐质量分数0.3%、0.5%、1.0%、1.5%的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养，于17 h取样，用灭菌的生理盐水进行系列10倍稀释，分别取适宜稀释度的菌液1 000 μL进行活菌计数，每个稀释度3次重复，37 ℃静置培养36～48 h后计数。

1.3.6 计算公式

ACE酶抑制率计算公式如下：

式中：A450（样品）为加入待测样品及酶液的反应液在波长450 nm处的吸光度值；
A450（blank1）为加入去离子水及酶液的反应液在波长450 nm处的吸光度值；
A450（blank2）为加入去离子水的反应液在波长450 nm处的吸光度值。

胃肠液内菌株存活率计算公式如下：

式中：N1表示人工胃肠液中培养不同时间后取样计数测得的活菌数，CFU/mL；
N0表示空白对照组，即0 h时测得的活菌数，CFU/mL。存活率为取对数值后的比例。

耐酸试验菌株存活率计算公式如下：

式中：N2表示不同pH条件培养后取样计数测得的活菌数，CFU/mL；
N0表示空白对照试验测得的活菌数，CFU/mL。存活率为取对数值后的比例。

耐胆盐试验菌株存活率计算公式如下：

式中：N3表示不同胆盐浓度条件培养后取样计数测得的活菌数，CFU/mL；
N0表示空白对照试验测得的活菌数，CFU/mL。存活率为取对数值后的比例。

1.3.7 数据处理

试验均进行3次重复实验，结果以“平均值±标准差”形式表示。差异显著性采用SPSS 19.0分析处理，P＜0.05表示显著影响，P＜0.01 表示极显著影响。

2.1 不同菌株发酵液ACE抑制率比较

由图1可知，12株试验菌株中有4株菌的ACE抑制率都在40%以上，表现出较好的ACE抑制作用，分别是鼠李糖乳杆菌HOD02-001、鼠李糖乳杆菌HCS01-013、鼠李糖乳杆菌HEX12-005、嗜酸乳杆菌AMA-01；
其中鼠李糖乳杆菌HCS01-013的ACE抑制率为61.54%，明显高于其他菌株，因此进一步对其耐受性进行研究。3株罗伊氏乳杆菌对ACE的抑制水平较为接近且普遍偏低，平均抑制率为21.16%，而瑞士乳杆菌的平均抑制率为36.09%。王睿等[20]研究利用碱性蛋白酶酶解双孢菇蛋白产生的ACE抑制率最大，此时ACE抑制率可达43.75%；
朱启鹏等[21]应用粉碎、超声获得生姜、枸杞、栀子的混合醇提物，以麦芽糊精、变性淀粉、两者混合分别与明胶作为复合包埋壁材，利用喷雾干燥制成微胶囊微胶囊经胃肠消化后其中ACE抑制率为49.64%。

图1 不同菌株发酵液ACE抑制率比较Fig.1 Comparison of ACE inhibition rates in fermentation broth of different strains

2.2 鼠李糖乳杆菌HCS01-013模拟胃、肠液试验结果

2.2.1 模拟胃液试验结果

由表2可知，与对照菌株相比，鼠李糖乳杆菌HCS01-013菌株在模拟胃液中的存活能力较强，经3 h处理，活菌对数值变化趋势较小，仍可达到9.14以上，且存活率达99.9%。说明鼠李糖乳杆菌HCS01-013在胃内有较高的存活率，为发挥益生作用提供基础。

表2 鼠李糖乳杆菌HCS01-013模拟胃液试验结果Table 2 Results of simulated gastric juice tests of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013

2.2.2 模拟肠液试验结果

由表3可知，鼠李糖乳杆菌HCS01-013菌株在模拟肠液中的活菌对数值略趋于一致，4 h后仍可达到9.1以上，此时存活率为99.7%，表明鼠李糖乳杆菌HCS01-013菌株在模拟肠液中的存活能力较强，能够以较高的活性进入肠液环境并存活。

表3 鼠李糖乳杆菌HCS01-013模拟肠液试验结果Table 3 Results of simulated intestinal juice tests of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013

2.3 菌株HCS01-013的耐酸环境能力测定结果

由表4可知，在pH 3.0的条件下，菌株HCS01-013的存活率为88.85%。在pH 2.0的条件下，活菌数虽有所下降，但存活率仍达71.95%，说明鼠李糖乳杆菌HCS01-013的耐酸性较好。

表4 鼠李糖乳杆菌HCS01-013在不同pH溶液中的活菌数及存活率Table 4 Viable count and survival rate of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013 in different pH solution

2.4 菌株HCS01-013的耐胆盐能力测定结果

由表5可知，在0.3%的胆盐质量分数环境下，菌株HCS01-013的存活率为99.67%，当胆盐质量分数提升到1.5%时，活菌数略下降，鼠李糖乳杆菌HCS01-013存活率为96.79%，说明其耐胆盐能力较强。

表5 鼠李糖乳杆菌HCS01-013不同浓度胆盐溶液中的活菌数及存活率Table 5 Viable count and survival rate of Lactobacillus rhamnosus HCS01-013 in bile salt solution of different concentration

试验表明，鼠李糖乳杆菌HCS01-013能够有效抑制ACE的活性，具有较强的降血压功能，同时在模拟人体胃肠道环境下有较强的耐受能力，在耐酸和耐胆盐试验中菌株存活率较高，能够通过耐受胃肠道环境到达肠道发挥降血压作用。ACE是使血压升高的关键性酶，而益生菌的降血压主要在于能够通过代谢产生蛋白酶，进而降解蛋白质产生的肽段对ACE产生抑制作用[22-23]。还有研究表明，某些益生菌能够产生γ-氨基丁酸，通过调节中枢神经系统，作用于脊髓的血管运动中枢，能有效的促进血管扩张，从而起到降血压的作用[24]。此外，吴正均等[25]研究发现，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）LC2W的细胞自溶物对原发性高血压大鼠具有显著的降压作用，而这种降压作用主要来自于细胞自溶物的多糖一肽聚糖复合物。试验仅从益生菌发酵乳对ACE活性的抑制这一方向入手，研究鼠李糖乳杆菌HCS01-013的降血压功能，后续研究可以从γ-氨基丁酸和菌体自溶物两个方向进行摸索试验，进一步探究鼠李糖乳杆菌HCS01-013的降血压机制。

本试验通过测定12种菌株发酵液的ACE抑制率，得到鼠李糖乳杆菌HCS01-013的ACE抑制率最高为61.54%。其在模拟胃液环境中存活率达99.9%；
在模拟肠液环境4 h后存活率为99.7%；
在pH2.0的条件下存活率仍达71.95%；
胆盐质量分数在1.5%时，存活率为96.79%，说明鼠李糖乳杆菌HCS01-013能够在胃液和肠道中发挥活性作用，且降血压能力较强，具有较高的降血压应用价值以及开发前景。