超声辅助酶法提取蓝靛果中绿原酸工艺研究

刘艳杰，邢振楠，王丹丽，马珂，刘邦

(黑龙江省林业科学院伊春分院，黑龙江 伊春 153000)

蓝靛果(LoniceraedulisTurcz.)落叶小灌木,忍冬科忍冬属[2]。常生长于寒带地区,植被越冬不需要抗寒,其果实中营养丰富,拥有多种人们日常所需的维生素、矿物质，另外它的花青素含量较高、普遍高于蓝莓中的花青素含量，因此常用来开发营养价值较高的保健品，在森林食品等方面广泛应用[3]。研究结果表明，蓝靛果的果实富含多种酚类物质，其中非花色苷酚类主要有绿原酸、新绿原酸、槲皮索-3-芸香糖苷和槲皮素-3-葡萄糖苷等。绿原酸是一种重要的生物活性物质，它又许多功效，其中抗肿瘤、降血压、血脂、清除自由基等功效最为显著[4]。因此,从蓝靛果中提取绿原酸具有很高的应用价值和经济价值，可以显著提高蓝靛果的经济附加值，实现蓝靛果的综合利用。超声波辅助提取法具有明显优势，可以明显提高提取效率，并且易实现大规模的工业化应用。同时，用酶法提取可以加快细胞壁结构破坏的速度和程度，显著改善提取效果[5]。然而，采用超声波辅助酶法提取蓝靛果中绿原酸活性成分的研究未见报道。以蓝靛果为原料，利用超声波辅助酶法提取绿原酸，并用正交实验对其提取条件进行了优化。为蓝靛果中绿原酸有效成分的提取探索一种新的途径。

蓝靛果(产于小兴安岭伊春)，绿原酸标准品、甲醇、中性蛋白酶，纤维素酶，果胶酶，淀粉酶均购自上海源叶生物科技有限公司，其他试剂均为分析纯。

真空泵、旋转蒸发仪、电子天平、分液漏斗、酸度计、移液器、电子天平、紫外可见分光光度计、超声波发生器、 恒温水浴祸、离心机等。

2.1 实验方法

2.1.1 蓝靛果中绿原酸酶法提取的单因素实验。将蓝靛果完全破碎以破碎作为实验原料，按照1∶10的比例加入水(料液比，w/w)，加入酶，用恒温酶解。经过酶解处理完成的蓝靛果用超声波作用30 min。分别实验提取温度、酶的种类、酶解的时间、酶的用量等对蓝靛果中绿原酸提取率的影响。

2.1.2 超声辅助酶法提取的显著性作用实验。在其他实验条件相同的情况下，比较酶法处理蓝靛果和超声辅助酶法处理蓝靛果对蓝靛果中绿原酸提取率的影响。

2.1.3 超声辅助酶法提取蓝靛果中绿原酸条件的优化。以单因素实验结果为基础，设置不同的酶解反应用量、酶解反应温度、酶解反应时间为实验指标因素，通过L9(34)正交实验，研究超声辅助酶法提取蓝靛果中绿原酸提取率的工艺，以优化出蓝靛果中绿原酸用酶法提取的最佳工艺参数。

2.1.4 分析方法[6]。参照朱松等的检测方法，采用高效液相色谱法定量分析提取出的绿原酸。

2.2 结果分析

2.2.1 酶种类对提取效果的影响。取蓝靛果处理后样品5 g，按照1∶10的料水比例，加入50 mL水，分别添加酶制剂，水浴锅中酶解温度设定为40 ℃，反应时间定时60 min，当水浴锅温度升高至85 ℃时灭酶，冷却至室温，用HPLC法测定产物中绿原酸含量，并根据公式计算提取率，结果见图1。由图一可以看出，用1%的纤维素酶处理后，得到的蓝靛果中绿原酸提取率最大，故蓝靛果中绿原酸提取的最佳酶制剂为纤维素酶[7]。

图1 酶种类对蓝靛果中绿原酸提取的影响

2.2.2 酶的用量对提取效果的影响。从图2可以看出，随着酶用量的增加，绿原酸的提取率是不断升高的，但当酶的用量达到1.5% 时，尽管酶的添加量再增加，对绿原酸的提取效果的影响却没有明显变化。分析原因可能当酶添加量未达到最佳量时，酶解反应进行得不十分完全，释放出的绿原酸量较少，当酶的添加量达到最适宜量时，酶解反应已经进行的较彻底，如果酶的用量再继续加大，反应进程不会有显著变化。

图2 酶用量对提取物的影响

图3 酶解时间对提取物的影响

由图3可以看出，随着酶解反应时间的增加，蓝靛果中绿原酸的提取率不断升高。当底物的酶解时间为1 h时，绿原酸提取率达到峰值。过了峰值后期反应趋于平缓，绿原酸的提取率相对稳定且缓慢下降。这可能是由于当酶的活力得到充分发挥后，酶解反应已进行的较完全，即使反应时间继续延长，绿原酸的提取率也不会增高。

2.2.3 酶解温度对提取效果的影响。图4表明，刚开始加入酶后，绿原酸的提取率是和酶解温度成正比的，酶解温度到达40 ℃时，提取率达到峰值。后期绿原酸的提取率随着反应温度的升高反而下降。其中可能因为一是酶的活性因温度的过高而降低，抑制酶解反应，因此绿原酸含量不再增加，甚至有降低的趋势[8]。二是绿原酸的邻苯二酚结构不稳定，酶解温度越高，易氧化分解。所以，最适宜的酶解温度为40 ℃[3]。

图4 酶解温度对绿原酸提取率的影响

2.2.4 超声作用对酶法提取率的显著性影响。超声波辅助法对蓝靛果中绿原酸有效成分提取的影响见表1。由表1可以看出，蓝靛果中绿原酸有效成分的提取应用超声波辅助法有显著影响，蓝靛果经超声波辅助作用后，其中绿原酸的平均提取率从85.2%提高到89.6%，分析原因，可能是由于蓝靛果的细胞结构被超声波作用后，进一步破坏，从而有效的提升了绿原酸的提取率。

表1 超声波处理对绿原酸提取的影响

2.3 正交实验优化提取工艺

在单因素实验数据的基础上，设计L9(34)正交实验(见表2、表3)。

表2 因素水平表

表3 正交实验方案及结果

表4 正交实验极差分析

由表4可以看出，各单因素对绿原酸提取率的影响大小的顺序为A>B>C，由此可确定最佳的提取方案为A3B3C2，即酶解法提取蓝靛果中绿原酸的最佳工艺及条件为：酶液量1%，40 ℃水浴中恒温处理1.5 h；
综合以上实验结果，提取蓝靛果中绿原酸的条件为1%的酶用量、1.5 h的酶解时间，50 ℃的酶解温度。

通过实验结果可知，在植物有效活性成分的提取实验中，可将纤维素酶和超声波两种办法结合起来。因为纤维素酶不但能促进植物体内有效成分的释放，而且是可将植物组织快速和彻底分解的一种有效酶制剂，其反应条件简单且不破坏生物体的活性。超声波辅助提取方法因其具有用时短、操作简单等优点，被广泛应用于森林食品天然产物有效成分的提取中。因此可将两种方法结合应用到植物活性成分的提取实验中。

实验得出了蓝靛果中绿原酸提取的最佳工艺条件为：1%酶的用量 、1.5 h酶解时间、40 ℃酶解温度。优化了超声辅助酶法提取蓝靛果中绿原酸的工艺，在最佳条件下，蓝靛果中绿原酸的提取率为89.6%。因此，可以得出结论，超声波辅助酶法提取蓝靛果中绿原酸，可显著提高提取率。