超高效液相色谱-串联质谱法测定土壤中8种农药残留

张大为

(实朴检测技术(上海)股份有限公司，上海 201108)

农药在农业生产中起着至关重要的作用，可以有效地防治病、虫、草害，保护作物，增加粮食产量[1-2]，但多数农药都具有一定的毒性，近年来农药的大量使用已经对生态环境造成严重污染，各环境中农药残留量超标，尤其是在食品中的农药残留通过食物链直接进入人体富集，引起中毒、致畸、致癌等疾病，给人类健康造成极大的危害[3-4]。因此农药残留问题一直是人们研究的热点问题，我国已制定了一系列相关法规来限制农药残留问题[5]。近10年，有关饮用水和食品中农药残留检测的标准比较多，可检测的农药的种类高达数百种，如《饮用水中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(GB/T 23214—2008)、《食品安全国家标准 植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(GB/T 23200.121—2021)、《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20769—2008)等。

农药残留的前处理技术有QuEChERS、固相萃取(SPE)、凝胶渗透色谱(GPC)、加速溶剂萃取法(ASE)等[6-9]。其中QuEChERS法是通过吸附剂与基质中杂质的相互作用来除去杂质，具有简单快速、省时经济、适用范围广的特点，在农药多残留检测中应用广泛[10-12]。固相萃取法是利用吸附剂与分析物的吸附作用，将分析物固定在吸附剂上，再用洗脱液洗脱，将分析物与干扰物分离，具有高效、减少杂质引入、高回收率的特点，适用于复杂基质样品的前处理[13-15]。文献报道中多种农药同时检测的方法主要有气相色谱法(GC)[16-17]、气相色谱质谱法(GC-MS)[18-19]、液相色谱法(LC)[20-21]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS)[22-25]等。其中GC法和GC-MS法不适用于受热易分解和部分不发挥性农药化合物的检测；
LC法可用于强极性、低挥发性和热不稳定性农药的分析，分离能力强，但对于复杂基质受干扰较大，检出限相对LC-MS较高[26]；
LC-MS技术同时具有色谱的强分离能力和质谱的高灵敏度、高选择性，可减少干扰物的影响，能够准确定性定量。

土壤作为重要的农药残留迁移媒介，越来越受到我国政府的重视。2017—2019年，生态环境部出台了一系列有关土壤和沉积物中农药残留检测的重要标准，如《土壤和沉积物 有机氯农药的测定 气相色谱-质谱法》(HJ 835—2017)、《土壤和沉积物有机氯农药的测定 气相色谱法》(HJ 921—2017)、《土壤和沉积物 氨基甲酸酯类农药的测定 柱后衍生-高效液相色谱法》(HJ 960—2018)、《土壤和沉积物 氨基甲酸酯类农药的测定 高效液相色谱-三重四极杆质谱法》(HJ 961—2018)、《土壤和沉积物 苯氧羧酸类农药的测定 高效液相色谱法》(HJ 1022—2019)、《土壤和沉积物 有机磷类和拟除虫菊酯类等47种农药的测定 气相色谱-质谱法》(HJ 1023—2019)、《土壤和沉积物 11种三嗪类农药的测定 高效液相色谱法》(HJ 1052—2019)等，这些标准大多采用GC法、LC法和GC-MS法，仅有标准HJ 961—2018采用LC-MS法。随着科技发展和社会进步，近年来环境中农药残留量会逐年降低，对其检测方法的灵敏度要求越来越高。开发高灵敏度LC-MS法来检测土壤中农药残留，对土壤中多种农药残留的监测具有重要意义。该研究采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱技术(LC-MS/MS)建立了同时测定土壤中甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果、乐果、甲基嘧啶磷、三环唑、萎锈灵和唑螨酯8种农药残留的分析检测方法，以期为土壤环境中多种农药残留的实时监测提供参考。

1.1 标准品与试剂8种农药标准品(甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧化乐果、乐果、甲基嘧啶磷、三环唑、萎锈灵和唑螨酯)，购自上海安谱实验科技公司，浓度均为100 μg/mL。甲醇和乙腈均为色谱级(美国Thermofisher公司)；
甲酸为LCMSMS级(国药试剂公司)；
超纯水(美国Millipore公司)；
C18吸附剂和PSA吸附剂(N-丙基乙二胺，40～63 μm，6 nm)，购自上海安谱实验科技公司；
PEP固相萃取柱(填料为二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物，500 mg/6 mL)和C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)，均购自天津博纳艾杰尔公司；
其他未注明的试剂均为国药分析纯。

1.2 仪器设备Xevo TQ-S micro超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国Waters公司)；
超声波清洗器、漩涡混合器、离心机、氮吹仪等其他实验室常规设备。

1.3 标准溶液配制分别准确吸取8种农药标准溶液，用乙腈稀释成1 mg/L混合标准溶液，4 ℃保存，准确吸取混合标准溶液用乙腈-水混合溶液(v/v=1/1)配制成浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的系列标准溶液。

1.4 样品前处理准确称取2.0 g土壤试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入适量硅藻土研磨均匀使样品均质，加入10 mL 0.1%甲酸乙腈溶液、3～5 g NaCl，涡旋混匀2 min，于超声清洗仪中超声30 min，以8 000 r/min离心5 min，取上层清液过0.45 μm微孔滤膜后备用。

PEP固相萃取柱净化法：依次加入6 mL 甲醇、6 mL 超纯水充分活化固相萃取柱。取5 mL提取液用超纯水稀释至100 mL过固相萃取柱，流速控制在约3 mL/min，用超纯水淋洗小柱，将固相萃取柱在负压条件下抽真空5 min进行干燥后，加入5 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液浸泡5 min后进行洗脱，流速控制在约3 mL/min，收集洗脱液于离心管中，在氮吹仪上用高纯氮气吹至近干，控制氮气流使溶剂表面有细微波动，1 mL初始流动相复溶，涡旋混匀，过0.22 μm微孔滤膜后，供LC-MS/MS分析。

PSA/C18吸附剂净化法：取5 mL萃取液于预先加入150 mg无水MgSO4、150 mg PSA、150 mg C18吸附剂的离心管中，涡旋2 min，以8 000 r/min离心5 min，取上层清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，供LC-MS/MS分析。

1.5 液相色谱条件色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱。流速0.4 mL/min。柱温40 ℃。

1.6 质谱条件电喷雾离子化源，正离子模式ESI；
离子源温度150 ℃；
脱溶剂气流量为1 000 L/h；
锥孔气流量为50 L/h。碰撞气为氩气；
脱溶剂气为N2。检测方式为多反应监测(MRM)，多反应监测条件见表1。

表1 8种农药成分的质谱分析条件

2.1 提取条件优化该试验分别采用乙腈、0.1%甲酸-乙腈溶液、0.1%甲酸-水溶液、0.1%甲酸-乙酸乙酯溶液4种提取溶剂对土壤中8种农药成分加标样(加标浓度为1 μg/kg)进行提取，比较其提取效率。结果表明(图1)，用乙腈提取的共提物较多，杂质干扰较大，目标化合物的响应值较差。考虑到8种农药中部分成分具有一定极性，在碱性介质中不稳定，在中性和酸性介质中稳定，且加入甲酸有助于提高目标化合物离子化效率，提高灵敏度，因此在提取剂中加入适量甲酸进行提取，结果发现0.1%甲酸-水溶液和0.1%甲酸-乙酸乙酯溶液对土壤中目标化合物的提取效率均较差，0.1%甲酸-乙腈溶液的提取效率较高。因此最终选择0.1%甲酸-乙腈溶液作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂的提取效率

2.2 净化条件优化该试验分别采用C18固相萃取柱、PEP固相萃取柱、150 mg PSA/150 mg C18吸附剂共3种净化方式对土壤中8种农药成分加标样(加标浓度为1 μg/kg)进行净化处理，比较回收率。结果表明，C18固相萃取柱净化法的回收率较差，PEP固相萃取柱和PSA/C18吸附剂净化法的回收率较高，达到86%～112%。其中PSA/C18吸附剂净化法操作简单高效，C18可清除样品基质中脂肪和酯类等非极性杂质，PSA可清除许多极性杂质，如脂肪酸、有机酸、部分色素等，对各种性能差异较大的农药残留物具有较高的回收率，因此该试验采用150 mg PSA/150 mg C18吸附剂对样品进行净化。如果样品基质复杂可采用PEP固相萃取柱净化法。

2.3 色谱质谱条件优化该试验分别采用乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L甲酸铵水共3种流动相组合对土壤中8种农药成分进行测定。结果表明，当采用乙腈-水作为流动相时，目标物的响应值较低，其中氧化乐果、甲胺磷、乙酰甲胺磷3种强极性化合物的色谱峰具有严重的溶剂效应，且基线噪音较大。当采用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时，有助于促进目标化合物离子化，提高响应强度，改善峰型。采用乙腈-5 mmol 甲酸铵水作为流动相时，部分化合物在碱性介质中不稳定。因此最终选择乙腈-0.1%甲酸水作为流动相。

该方法以乙腈和0.1%甲酸水为流动相，采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色谱柱进行梯度优化。鉴于强极性目标物的出峰时间较早，影响检测，用起始流动相平衡1 min，延迟强极性目标物的出峰时间，进而调整流动相的比例及其变化速率，使8种农药成分的色谱峰彼此分离。该方法可在10 min内完成土壤中8种农药成分的分离检测，峰型尖锐，分离效果良好。

采用浓度为1 mg/L的8种农药标准溶液进行质谱参数的优化。分别在正离子和负离子模式下进行母离子扫描，发现在正离子模式下目标化合物母离子响应较高，且容易获取H+，进一步优化毛细管电压、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数，使每种目标化合物的母离子和子离子的峰响应强度达到最高，并找出响应强度高且稳定存在的2个特征碎片离子作为定量离子和定性离子。优化后8种农药成分多反应检测MRM图谱如图2所示。

注：a.甲基嘧啶磷(6.13 min);b.唑螨酯(6.30 min);c.乐果(4.24 min)；
d.萎锈灵(4.42 min);e.甲胺磷(1.13 min)；
f.三环唑(3.49 min);g.氧化乐果(1.99 min)；
h.乙酰甲胺磷(1.50 min)

2.4 线性方程和检出限取“1.3”中所配制的系列标准溶液，在“1.5”和“1.6”的仪器条件下按浓度由低到高的顺序依次进样测定，以目标化合物各组分定量离子峰面积为纵坐标(Y)、以其对应的系列浓度为横坐标(X)，建立标准曲线。结果表明(表2)，8种农药在0.1～100.0 μg/L线性关系良好(R2≥0.995)，且8种农药的检出限均为0.1 μg/kg，定量限均为0.4 μg/kg。

表2 8种农药成分的线性方程和检出限

2.5 精密度和准确度试验取某农药场地土壤样品，用8种农药混合标准溶液加标后制备成浓度为1 μg/kg的加标样6份，经前处理后，上机测定，计算6次平行测定的相对标准偏差(RSD)和加标回收率。结果表明(表3)，8种农药成分的RSD在0.709%～2.740%，加标回收率在82.4%～109.0%，表明该方法的加标回收率和精密度良好。

表3 土样中8种农药成分的精密度和加标回收率(n=6)

2.6 实际样品定量分析采集某农药场地土壤样品进行了定量分析，结果表明，萎锈灵的浓度为0.6 μg/kg，加标回收率为85.0%；
三环唑的浓度为0.7 μg/kg，加标回收率为104.0%;其他目标化合物均未检出。该方法灵敏度高、稳定性好，满足土壤中多种农药残留定量检测的要求。

该研究建立了可同时测定土壤中8种农药残留量的超高效液相色谱-串联质谱分析法。用0.1%甲酸-乙腈溶液提取，用PSA/C18吸附剂净化，以乙腈和0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱分离，采用多反应监测模式，同时完成8种农药残留的定性定量分析。该方法操作简便、经济高效、灵敏度高，具有良好的精密度、准确度和线性关系，适用于土壤中多种农药残留量的检测，为土壤中多种农药残留的实时监测提供依据。