铜对低温胁迫下空气凤梨抗寒生理特征的影响

丁久玲，孟海涛，郑 凯*

(1.江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400；
2.江苏句容慢生活生态农业有限公司，江苏句容 212400)

空气凤梨(Tillandsia)为凤梨科(Bromeliaceae)铁兰属(Tillandsia)多年生草本植物，包括近550个品种和90个变种。20世纪80年代开始在国外流行起来，我国近几年开始引进。因其栽培不需泥土，能吸收甲醛、重金属等有害物质，一经引进就受到许多人的喜爱和关注。

目前空气凤梨相关研究限于其作为空气污染指示植物和去除环境污染的修复植物[1-4]及地域分布[5]、开花性状[6-7]、栽培管理[8-10]、繁殖技术[11-13]等方面。然而，关于空气凤梨抗寒性的文献较少。俞禄生等[14]研究认为，供试松萝等5种空气凤梨可以短期耐受-5～0 ℃低温。鲍荣静等[15]从相对电导率和成活率证明了3种空气凤梨抗寒能力大小。郑桂灵等[16]研究表明，硬叶空凤与贝可丽空凤对-5 ℃低温有一定的耐受性，但会失绿、萎蔫，该温度已达到或超过空气凤梨生长的临界温度。同时，江苏农林职业技术学院自2006年开始引种驯化空气凤梨，栽培管理中发现，大部分空气凤梨品种冬季养护需温室大棚方能顺利过冬，否则会出现植株叶片受冻受损甚至死亡的现象，表现出较差的抗寒性。长江中下游江苏、安徽等地区冬季不开空调，室内温度较低，甚者会低于-5～-10 ℃，在该低温环境下，适于室内微景观装饰的空气凤梨的生长势必会受到不良影响。空气凤梨品种抗寒性不佳的状况在一定程度上会影响其在市场上规模化的推广应用。因此，有必要开展空气凤梨抗寒性及提高其抗寒性的探讨。

关于空气凤梨抗寒性的研究较少，有关提高其抗寒性的研究鲜见报道。近年来，通过水杨酸、聚乙二醇、Ca2+、铜等外源调控物质来缓解低温对植物造成伤害的研究成为备受关注的焦点和热点。相关研究表明[17-21]，铜是植物正常生命活动的微量营养元素，可以在一定程度上提高小麦、华北落叶松、仁用杏、烟草等植物的抗寒性。为满足空气凤梨日以增长的市场需求，笔者基于铜可有效提高植物抗寒性的理论知识和发明专利(ZL201510609276.4)的相关授权内容，进一步探讨外源物铜对低温胁迫下空气凤梨抗寒生理特征的影响及其有效提高其抗寒性的铜适宜浓度等关键难题，丰富空气凤梨抗寒性机制理论，为解决低温对空气凤梨的胁迫问题提供有效的方法和手段，以期为空气凤梨广泛地推广提供理论依据和技术支持。

1.1 供试材料供试材料为维路提(T.velutina)、小精灵(T.ionantha)、斯垂科(T.stricta)、贝克立(T.brachycaulos)、休斯顿(T.houston)、松萝(T.usneoides)6个空气凤梨品种的无性繁殖系，且已于温室内培养驯化3年为成苗。

1.2 试验方法试验于12月至翌年2月在空气凤梨生产基地进行。每个供试品种挑选大小基本一致的植株，剪除植株周围的枯叶短叶，在温室中恢复15 d后进行铜处理。该温室内设温控、风机、遮阳网、水帘、微喷等设备，空气湿度75%～90%。用硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)对空气凤梨进行浸泡处理0.5 h。Cu2+处理设为7个，浓度分别为0、40、80、100、150、200、250 mg/L，其中0 mg/L为对照(CK)，处理编号分别为CK、T1、T2、T3、T4、T5、T6。每处理3次重复，每个重复每个品种选取生长一致的空气凤梨植株30株。

Cu2+处理后将空气凤梨置于室外自然低温下，即处于低温胁迫状态。试验期间室外最低温度在-5～5 ℃，室外最高温度在10～15 ℃。每14 d用1 000 mg/L的氮、磷、钾比例为17∶8∶22的肥料对空气凤梨喷施1次，每隔4 d喷水1次，肥料和水pH 6.0～7.0。试验期间定期观测植物生长状况，60 d后取样测定生理指标。

1.3 测定项目电解质渗出率(REC)测定采用电导仪法[22]，叶绿素(Chl)含量测定采用乙醇提取法[22]，脯氨酸(PRO)含量采用脯氨酸分光光度计试剂盒法测定，丙二醛(MDA)含量采用丙二醛分光光度计试剂盒法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采利用超氧化物歧化酶分光光度计试剂盒法测定，过氧化物酶(POD)活性采用过氧化物酶分光光度计试剂盒法测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用过氧化氢酶分光光度计试剂盒法测定。以上试剂盒由苏州科铭生物技术有限公司提供。

2.1 铜对低温胁迫下空气凤梨叶片叶绿素(Chl)含量的影响叶绿素是植物进行光合作用时捕获光能的重要物质，其含量的增加可以在一定程度上提高光合速率的转换，促进植物生长，进而间接提高植物的抗逆性，是研究光合生理的重要指标之一[23]。不同浓度铜处理对供试空气凤梨Chl含量的影响不同(图1)。随着铜浓度的增加，低温胁迫下各品种Chl含量呈先升高后降低的趋势，T3或T4处理Chl含量最大(显著高于CK与其他处理)，处理T6最小。小精灵、松萝和斯垂科3个品种T5和T6处理的Chl含量显著低于CK，维路缇、贝克立和休斯顿3个品种CK的Chl含量显著低于T5处理，高于T6处理。由此可知，并不是铜浓度越高越利于低温胁迫下空气凤梨Chl含量的增加，只有适宜浓度的铜才可以使低温胁迫下空气凤梨Chl含量显著增加，促进其生长。该研究发现，当铜浓度为80～150 mg/L时，低温胁迫下供试空气凤梨Chl含量显著高于CK和其他处理；
当铜溶液浓度过高时(250 mg/L)，Chl含量反而显著降低，低于CK，抑制空气凤梨生长，不利于抵御严寒。

注：不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)

2.2 铜对低温胁迫下空气凤梨游离脯氨酸(PRO)含量的影响低温条件下，植物会主动合成和积累某些物质来降低细胞液的渗透势，有效避免细胞过度脱水，从而完成渗透调节过程。PRO是主要的渗透调节物质之一，其含量在一定程度上可以反映植物的抗寒性[24]。不同浓度的铜对低温胁迫下空气凤梨PRO含量的影响有所不同(图2)。从图2可见，随着铜浓度的增加，低温胁迫下空气凤梨PRO含量呈先升后降的趋势，T3或T4处理的PRO含量最大，大部分品种(小精灵除外)以T6处理最小。供试空气凤梨(休斯顿除外)T1和T2处理的PRO含量显著高于CK，而休斯顿T2处理的PRO含量显著高于CK。各品种T3和T4处理的PRO含量均显著高于CK和其他处理，2个处理间差异显著(休斯顿除外)。T5和T6处理与CK对比其PRO含量表现各不相同：小精灵T5和T6处理的PRO含量显著高于CK，且2个处理间差异显著；
松萝T5处理的PRO含量显著高于CK，而T6处理显著低于CK；
斯垂科T5和T6处理的PRO含量均显著低于CK；
维路缇、贝克立和休斯顿3个品种的CK与T5处理相比PRO含量差异不显著，而CK显著高于T6处理。

注：不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)

由以上分析可知，外施80～150 mg/L的铜可使低温胁迫下供试空气凤梨PRO含量显著增加，缓解空气凤梨因遭受低温受到的伤害；
当铜浓度为250 mg/L时，PRO含量显著下降，甚至显著低于CK，造成植物细胞严重脱水，抗寒性显著降低。

2.3 铜对低温胁迫下空气凤梨细胞膜系统的影响

2.3.1对丙二醛(MDA)含量的影响。植物细胞膜系统是遭受低温伤害的首要部位，脂质过氧化作用启动，MDA 迅速积累，使细胞膜的完整性受损[25]。通常利用MDA作为脂质过氧化指标，反映细胞脂质过氧化程度和植物对低温逆境反应的强弱，其含量高低与植物抗寒性强弱成反比。不同浓度铜处理对空气凤梨MDA含量的影响有所不同(图3)。从图3可见，随着铜浓度的增加，低温胁迫下空气凤梨(小精灵除外)MDA含量呈先降低后升高的趋势，T3或T4处理MDA含量最小，T6处理最大。其中，小精灵、松萝、斯垂科和维路缇4个品种T1、T2和CK处理间的MDA含量差异不显著；
贝克立和休斯顿2个品种T1处理的MDA含量与CK相比差异不显著，T2处理低于CK，T1和T2处理间差异不显著。T3和T4处理的MDA含量低于CK和其他处理，且2个处理间差异不显著(松萝、贝克立和休斯顿除外)。供试品种T5和T6处理的MDA含量显著高于CK和其他处理，且T6处理的MDA含量显著大于T5处理(斯垂科除外)。

注：不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)

由此可认为，并不是铜浓度越高越利于低温胁迫下供试空气凤梨MDA含量的降低，只有适宜浓度的铜才可以使空气凤梨MDA含量显著降低，提高其抗寒性。该研究发现，当铜溶液浓度为100～150 mg/L时，供试空气凤梨MDA含量显著低于CK和其他铜处理，与CK相比，降低率达27.1%～41.1%；
当铜浓度过高时(200～250 mg/L)其MDA含量反而会增加，显著高于CK和其他铜处理。

2.3.2对电解质渗出率(REC)的影响。低温条件下，植物的细胞膜通透性增大，电解质大量向细胞外渗透，导致REC增加。REC是评定植物抗逆境能力的指标之一，REC越高，说明植物受到的伤害越大，其抗寒性越低；
REC越低，说明植物受伤害越小，其抗寒性越高。该研究在自然低温状态下对不同空气凤梨品种进行铜处理，通过测定不同铜浓度下各品种的REC，确定铜是否能提高空气凤梨的抗寒性。

不同浓度铜处理对低温胁迫下空气凤梨REC的影响与MDA含量表现一致(图4)，均呈先降低后升高的趋势，T3或T4处理最低，T6处理最高，且各品种的REC与MDA含量呈明显的相关性，其相关系数分别为：小精灵0.987、松萝0.867、斯垂科0.986、维路缇0.872、贝克立0.969和休斯顿0.995。小精灵、松萝、斯垂科和贝克立4个品种T1、T2和CK处理间的REC差异不显著；
维路缇和休斯顿2个品种T1处理与CK间差异不显著，T2处理显著低于CK，T1与T2处理间差异不显著。各品种T3和T4处理的REC显著低于CK和其他处理，2个处理间差异显著。T5和T6处理下空气凤梨REC显著高于CK和其他处理，且T6处理的REC显著大于T5处理。

注：不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)

据此可判断，铜浓度过低(≤80 mg/L)，低温胁迫下空气凤梨的REC降低不明显；
只有适宜浓度的铜(100～150 mg/L)才可使空气凤梨REC显著降低，降低率为34.2%～47.4%；
当铜浓度较高(200～250 mg/L)时空气凤梨REC不但没有降低，反而急剧增加，显著高于CK和其他铜处理，植物受到的伤害显著增大。

2.4 铜对低温胁迫下空气凤梨抗氧化酶活性的影响

2.4.1对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响。低温胁迫会使植物体内积累有毒害作用的活性氧，过多的活性氧攻击细胞膜，使植物受到不良伤害。在植物抗氧化系统中，SOD、POD等是消除活性氧的重要保护性酶类，可以有效减轻植物细胞膜的过氧化伤害[26]。从图5可以看出，不同浓度铜处理对低温胁迫下空气凤梨SOD活性的影响不同。随铜浓度的增加，空气凤梨SOD活性呈先升后降的趋势，T3或T4处理的SOD活性最大，T6处理最小。各供试空气凤梨品种(松萝除外)T1和T2处理的SOD活性显著高于CK，而松萝T2处理的SOD活性显著高于CK。各品种T3和T4处理的SOD活性均显著高于CK和其他处理，且2个处理间差异显著(休斯顿除外)。小精灵和松萝2个品种CK与T5处理相比SOD活性差异不显著，但显著高于T6处理；
斯垂科、维路缇、贝克立和休斯顿4个品种CK的SOD活性显著高于T5和T6处理。

注：不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)

据以上分析可认为，外施80～150 mg/L铜溶液可使低温胁迫下空气凤梨SOD活性显著增强，有效缓解活性氧对空气凤梨造成的不良伤害；
当铜浓度≥200 mg/L时，SOD活性反而下降，甚者显著低于CK，说明空气凤梨的抗寒性显著降低。

2.4.2 对过氧化物酶(POD)活性的影响研究表明[27]，POD是植物体内抗氧化系统的组成部分，可以抵御细胞发生膜质过氧化，POD酶活性高低与抗寒性强弱密切相关。随着铜浓度的增加，低温胁迫下空气凤梨POD活性的变化趋势与SOD活性相似(图6)，呈先升后降的趋势，以T3或T4处理的POD活性最大(显著高于CK和其他处理)，T6处理的POD活性最小(显著低于CK和其他处理)。小精灵、松萝、斯垂科和维路缇4个品种T1和T2处理的POD活性显著高于CK；
贝克立和休斯顿T1处理和CK的POD活性差异不显著，T2处理的POD活性显著高于CK。松萝、贝克立的T5处理的POD活性显著低于CK；
小精灵、维路缇、斯垂科、休斯顿4个品种CK与T5处理的POD活性差异不显著。

注：不同小写字母表示同一品种不同处理间差异显著(P<0.05)

根据不同浓度的铜对低温胁迫下空气凤梨POD活性的影响可知，外施80～150 mg/L的铜可显著增加空气凤梨的POD活性，提高其抗寒性，缓解低温胁迫的伤害；
当铜浓度为250 mg/L时其POD活性显著下降，植物的抗寒性降低。

叶绿素与植物的光合生理特征及生长密切相关，其含量的变化能反映低温对植物的伤害程度[28]。铜是植物所需的微量元素之一，另外，因叶绿素中有含铜酶，叶绿素的形成与铜有关，故一定浓度的铜可以提高空气凤梨的Chl含量，增强光合作用，促进其生长。朱振乾等[21]研究发现，CuSO4为80 mg/L时，低温胁迫下的烟草幼苗Chl含量较高，光合能力较强；
朱启红等[29]研究认为，低浓度铜对灯芯草Chl合成有促进作用；
谢潜渊等[17]研究证明，CuSO4能使低温胁迫下的小麦叶绿素色素稳定性增强，有效提高小麦的抗寒性。该研究结果与以上报道基本一致，表明外施铜浓度为80～150 mg/L时空气凤梨Chl含量显著增加，生长良好。铜作为重金属，浓度过高可诱发植物过氧化作用，破坏叶绿体、类囊体膜的结构和功能，使光合过程的联系阻断，使光合作用严重受阻[30]，这可能是当铜浓度为250 mg/L时空气凤梨Chl含量反而显著降低的原因之一。

PRO是有效的渗透调节物质，可平衡细胞渗透压，维持细胞膜结构，通过防止细胞膜脂质过氧化来降低低温胁迫对空气凤梨造成的伤害，其含量增加可提高植物的抗寒性[24]。铜元素作为植物所需的微量元素，同时亦属重金属范畴，对植物体内PRO含量的影响普遍认为是低促高抑。孟衡玲等[31]研究表明，低浓度铜处理(100、200 mg/L)使金银花PRO含量呈上升趋势，高浓度铜处理(400、800 mg/L)使PRO含量呈下降趋势。周娜娜等[32]研究认为，随着铜浓度的增加，花生幼苗的PRO含量呈先升后降的趋势。该研究亦得出了相似的结论，认为外施浓度相对较低的铜(80～150 mg/L)可以促进空气凤梨PRO的累积，有效减缓低温伤害；
高浓度的铜(250 mg/L)使空气凤梨PRO含量显著降低，加剧植物受害程度，降低抗寒性。

植物细胞膜在逆境胁迫下其完整性遭到破坏，通透性增大，脂质过氧化作用增强，导致MDA大量积累，REC急剧增加，故通常用MDA含量和REC这2个指标反映植物对逆境的适应能力，指标值越大，说明植物受害越重，反之则植物受到的伤害越轻，其抗性越强[25]。试验表明[20]，铜处理可有效抑制仁用杏细胞膜的脂质过氧化作用(即植物细胞膜脂质过氧化产物MDA含量的降低)，降低细胞膜受损程度，使仁用杏抗寒性得到提高。该研究通过MDA含量和REC这2个指标来综合反映铜对低温胁迫下空气凤梨细胞膜稳定性的影响，证明了二者具有较强的相关性，即细胞膜通透性增加的同时其脂质过氧化亦加剧；
并不是铜浓度越高越利于空气凤梨MDA含量和REC的降低，只有铜浓度为100～150 mg/L时，供试空气凤梨细胞膜脂质过氧化作用和透性显著降低，稳定性增强，细胞膜受损程度显著降低，进而显著提高空气凤梨的抗寒性。

低温胁迫下，植物细胞内活性氧代谢平衡紊乱，过多的活性氧攻击细胞膜，导致植物受到伤害，故及时清除活性氧至关重要。SOD和POD作为重要的抗氧化酶类，协同作用可以有效降低植物体内因低温胁迫累积的活性氧浓度，抵御细胞膜的过氧化伤害[27]。有文献表明[33]，铜是SOD酶的组成成分，参与消除超氧自由基的伤害作用，对植物生长发育具有不可替代的作用。杨秀清[20]研究表明，铜通过增强仁用杏SOD活性而使超氧自由基含量降低，从而抑制细胞脂质过氧化作用来提高其抗寒性。李涛等[34]研究认为，铜作为SOD同工酶的辅基之一，其适量增加可增强黄瓜幼苗SOD活性，进而提高黄瓜的抗冷性。朱振乾等[21]研究报道，80 mg/L CuSO4可使低温下烟草POD和PRO增加，有效清除烟草体内多余的活性氧，增强抗冷性。笔者将常见的抗氧化酶(SOD和POD)结合起来反映铜处理对低温胁迫下空气凤梨活性氧变化的影响，结果表明，外施80～150 mg/L的铜可使供试空气凤梨SOD和POD活性显著增加，二者变化趋势一致，对有效缓解低温胁迫累积的活性氧造成的伤害表现出协同性，平衡性得以维持；
同时，适宜浓度的铜处理空气凤梨SOD和POD活性的增加与细胞膜脂质过氧化作用(MDA和PRO)受到抑制及细胞膜透性(REC)的降低相吻合，说明空气凤梨通过自身调节机制适应了低温环境对其自身的氧化胁迫，维持了机体内自由基代谢的动态平衡。

该研究表明，不同浓度的铜处理对低温胁迫下空气凤梨抗寒生理特征的影响有所不同。随着铜浓度的增加，各品种Chl含量、PRO含量、抗氧化酶活性的变化均呈先升高后降低的趋势，表现细胞膜透性的MDA含量和REC变化趋势表现为先降低后升高。综合各抗寒生理特征，在低温胁迫下，铜浓度过高或过低均不利于空气凤梨抵御低温胁迫，适宜的铜浓度(100～150 mg/L)下空气凤梨Chl含量、PRO含量、抗氧化酶活性均较高，MDA含量和REC较低，植物生长良好，渗透势稳定，细胞膜脂质过氧化伤害有效降低，抗寒性显著提高。