猪流行性腹泻病毒G2a变异株CH-HK-2021的分离鉴定及其遗传进化分析

彭棋，张雪，2，赫文龙，范宝超，王丹丹，刘茂军，李彬，2*

（1江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏南京 210014；
2南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095）

【研究意义】猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一种急性、高度接触性猪肠道传染病，其主要特征是仔猪发生严重的腹泻、脱水和高致死率，尤其是1周龄内的仔猪死亡率可高达100%（朱琳等，2018；
丁方艺等，2021）。自1971年英格兰首次报道PED以来，PED在欧洲国家主要以零星散发的形式出现，并未对养猪业造成较大的经济损失。2010年底，由PEDV变异株导致的PED在我国南方开始暴发，席卷了我国大部分养猪场，给我国的养猪业造成巨大经济损失（Li et al.，2012；
王隆柏等，2020）。2013年5月由PEDV变异株引起的PED在美国暴发，仅一年之内给美国造成约10%的仔猪死亡（Schulz and Tonsor，2015）。目前，PED依然是影响世界养猪业的主要猪病之一（Wang et al.，2016；
Antas and Wozniakowski，2019）。因此，分离鉴定当前PEDV的流行株，对PEDV新型疫苗及诊断试剂的研发具有重要意义。【前人研究进展】PEDV是冠状病毒科（Coronaviridae）α-冠状病毒属（Alpha-Coronavirus）的成员之一，其病毒基因组全长约28 kb，具有典型的5′端7-甲基鸟苷三磷酸（m7gtp）帽子结构和3′端poly（A）尾巴结构。病毒基因组包含7个开放阅读框，编码多聚蛋白pp1a和pp1ab、纤突蛋白（Spike protein）、ORF3、包膜蛋白（Envelope protein）、膜蛋白（Membrane protein）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein）（Kocherhans et al.，2001）。其中，多聚蛋白pp1a和pp1ab可被非结构蛋白nsp5和木瓜样蛋白酶切割成16个非结构蛋白，而大部分非结构蛋白是病毒转录、复制复合体的重要组成成分（Thiel et al.，2003）；
纤突蛋白是病毒与宿主细胞受体相互作用介导病毒入侵细胞的重要蛋白，且纤突蛋白拥有多个主要的中和表位，对诱导宿主产生中和抗体起重要作用（Fu et al.，2017；
Li et al.，2017）；
ORF3是PEDV复制非必需的辅助蛋白，是一个非经典的离子通道蛋白（Wang et al.，2012；
Peng et al.，2020）；
包膜蛋白和核衣壳蛋白是病毒粒子中含量较高的结构蛋白，其编码基因相对较保守，是用于设计检测病毒的重要靶基因/蛋白（Peng et al.，2022）。PEDV是一种在体外难以培养的病毒，体外增殖过程一般需要额外添加胰蛋白酶。胰蛋白酶的作用是对病毒纤突蛋白进行切割，帮助病毒入侵细胞和释放（Tan et al.，2021）。至今，国内外已有成功分离获得PEDV的相关研究报道，Pan等（2012）首次在国内分离获得PEDV G2b变异株，Chen等（2014）从死于腹泻仔猪的肠道中分离获得PEDV变异株，Li等（2021）分离出1株PEDV重组变异株并对其致病性进行研究。PEDV体外分离培养依然较困难，严重阻碍其致病机理及疫苗研发等工作的开展。【本研究切入点】PEDV疫苗研发的前提是获得对应的流行毒株。本课题组近期从我国海南等地暴发PED的猪场采集到PEDV阳性样品，通过分离当前流行毒株，了解其生物学特性及其遗传演化关系，为研发PEDV疫苗提供候选疫苗毒株。【拟解决的关键问题】通过分离当前的PEDV流行株，测定流行株的全基因组信息，并分析其遗传进化关系及变异株各亚型间的抗原性差异位点，以期为PEDV新型疫苗及诊断试剂盒的研发打下基础，同时了解当前PEDV流行株的遗传演化关系。

1.1 试验材料

病料样品为2021年3月采自海南省海口市规模养猪场死于腹泻的仔猪肠道组织。非洲绿猴肾细胞（Vero）和小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体均由江苏省农业科学院兽医研究所动物腹泻病防控创新团队保存提供；
FITC标记羊抗鼠IgG购自安诺伦（北京）生物科技有限公司；
RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体和小鼠抗β-actin IgG抗体购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 RNA提取与RT-PCR鉴定

采用宋德平（2016）设计的引物（表1）进行反转录及PCR扩增。按照RNA提取试剂盒说明提取病料总RNA，然后反转录合成cDNA。反转录体系20.0 μL：4.0μL 5×HiScript II qRT SuperMix II，16.0μL RNA。反转录程序：50℃15 min，85℃5 s。获得cDNA后立即进行PCR扩增，PCR反应体系25.0μL：10×Buffer 2.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1.0μL，dNTPs 1.0μL，rTaq聚合酶0.25μL，cDNA模板2.5μL，ddH2O补足至25.0μL。扩增程序：95℃预变性3 min；
95℃30 s，53℃30 s，72℃1 min，进行34个循环；
72℃延伸5 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性PCR扩增产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。

1.3 病毒分离

对RT-PCR检测和测序鉴定呈PEDV阳性的病料进行处理，尝试分离PEDV。剪取仔猪肠道组织约1.0 g，加入2 mL病毒维持液［含5.0μg/mL胰酶（Sigma）和37.5μg/mL胰液素（Sigma）的DMEM］，混匀。使用匀浆器在冰水浴上对仔猪肠道组织进行研磨，研磨均匀的样品4℃下12000 r/min离心10 min，收集上清液，用0.22μm滤器过滤，滤液以病毒维持液进行等体积稀释。长满单层Vero细胞的6孔细胞板用病毒维持液洗2次，每孔加入500.0μL稀释后的样品，置于37℃、5% CO2培养箱中吸附2 h，每孔再加入病毒维持液至2 mL。将6孔细胞板置于37℃、5% CO2培养箱继续培养，每天观察细胞状态，直至出现细胞病变。若3 d后无明显细胞病变出现，则将细胞置于-80℃冻存1次，继续盲传。同时按照1.2的方法检测PEDV含量是否逐渐增多，若检测条带越来越淡，则弃之。

1.4 病毒鉴定

1.4.1 间接免疫荧光试验（IFA）将Vero细胞接种至24孔细胞板，待细胞长至单层后以病毒维持液洗板2次，然后接种200.0μL病毒液，置于37℃、5% CO2培养箱中吸附2 h，每孔再加入病毒维持液至1 mL，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养。待细胞出现病变后，以PBS洗涤3次，用4%多聚甲醛固定15 min。然后每孔加入300.0μL预冷甲醇透化10 min，PBS洗涤3次。每孔加入300μL的10%脱脂奶粉，37℃孵育1 h后用PBS再洗涤3次。加入1∶500倍稀释的小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体，37℃孵育1 h后用PBS洗涤3次；
再加入1∶500倍稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体，37℃避光孵育1 h，弃除二抗，加入300.0μL的0.01% DAPI，37℃避光孵育15 min，PBS洗涤3次，置于倒置荧光显微镜下观察。

1.4.2 Western blotting鉴定6孔细胞板接种Vero细胞，分别感染CH-HK-2021和AH2012/12（G2b变异株），待细胞出现病变后收集样品。100℃煮沸10 min后进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转印至硝酸纤维膜上，以5%脱脂奶粉封闭2 h，置于小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体或小鼠抗β-actin IgG抗体中4℃摇床孵育8 h，转速不超过80 r/min。孵育完成后，用1×TBST在4℃、100 r/min的条件下清洗2次，每次7 min；
直接加入1∶2000倍稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体，4℃摇床孵育2 h，转速不超过80 r/min，再以1×TBST在4℃、100 r/min的条件下清洗2次，每次7 min，然后进行显色。

1.4.3 RT-PCR鉴定及电镜观察使用表1中的引物（PEDV-18F和PEDV-18R）对PEDV分离株进行RTPCR鉴定。RNA提取后反转录及PCR扩增程序同1.2。病毒电镜观察参照Fan等（2017）的方法：取20 mL病毒液在4℃下3500 r/min离心30 min，收集上清液，以0.22μm滤器过滤去除细胞碎片；
去除细胞碎片的病毒液在4℃下41000 r/min离心2 h，用2%磷钨酸（pH 7.0）对病毒粒子进行负染，然后进行电镜观察。

1.5 病毒增殖特性分析

将Vero细胞接种至12孔细胞板，待细胞长至单层后以病毒维持液洗涤2次，每孔加入0.1 MOI病毒液，37℃孵育2 h后每孔加入病毒维持液至1 mL。将细胞板置于37℃、5% CO2培养箱培养，分别在病毒感染12、24、36和48 h后收集样品，通过TCID50测定病毒滴度。根据病毒滴度绘制病毒体外增殖动态曲线。

1.6 病毒基因组生物信息学分析

采用已发表文献中的引物（Song et al.，2015；
宋德平，2016）对分离株进行全基因组扩增，引物序列信息见表1。PCR反应体系及扩增程序同1.2。使用Lasergene中的SeqMan完成序列拼接，然后以MEGA 7.0进行遗传进化分析；
并采用Protean中的Jameson-Wolf算法进行抗原性分析。

表1 扩增PEDV全基因组的引物序列信息Table 1 Primer sequence information of amplification of whole genome of PEDV

2.1 PEDV流行株分离结果

将3份呈PEDV阳性的仔猪肠道组织样品处理后接种至长满Vero细胞的6孔细胞板中，结果发现盲传至第6代时，其中1份样品能导致Vero细胞产生病变，主要表现为细胞塌陷，或细胞融合形成合胞体，最终脱落（图1），将分离的毒株命名为CH-HK-2021。CH-HK-2021毒株在Vero细胞上继续进行传代，发现该毒株能在Vero细胞上稳定传代，并形成典型的细胞病变，目前已传至100代。

2.2 分离毒株鉴定结果

分别采用IFA和Western blotting对CH-HK-2021毒株进行鉴定，结果显示，分离获得的CH-HK-2021毒株能与小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体发生特异性反应（图2-A），且N蛋白主要分布在胞浆中，说明CH-HK-2021毒株即为PEDV。Western blotting检测结果也显示，通过小鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体能在感染CH-HK-2021毒株的Vero细胞中检测到N蛋白（图2-B），进一步证实分离毒株为PEDV。

提取感染CH-HK-2021毒株的Vero细胞样品RNA，RT-PCR鉴定结果显示，感染CH-HK-2021毒株的Vero细胞样品均能扩增获得预期的目的条带（图3-A），证明分离获得的CH-HK-2021毒株即为PEDV。电镜观察结果显示，CH-HK-2021毒株的直径在80～120 nm，且病毒粒子表面带有刺突样的形状（图3-B），属于冠状病毒。

2.3 病毒增殖特性分析结果

为了解CH-HK-2021毒株在Vero细胞中的增殖特性，将Vero细胞接种至12孔细胞板，待细胞长成单层后，接种0.1 MOI的CH-HK-2021和AH2012/12毒株。分别于病毒感染12、24、36和48 h后收集样品，通过TCID50测定病毒滴度，并绘制病毒增殖动态曲线。由图4可看出，CH-HK-2021毒株与AH2012/12毒株具有相似的增殖动力学，但病毒滴度较AH2012/12毒株低。CH-HK-2021和AH2012/12毒株在感染Vero细胞后其病毒滴度逐渐升高，至感染24 h时的滴度达最高值，分别为105.6TCID50/mL和106.7TCID50/mL；
随后CH-HK-2021和AH2012/12毒株的滴度均呈逐渐降低趋势。

2.4 分离毒株全基因组序列扩增及其遗传进化分析结果

将CH-HK-2021毒株基因组分成33段进行PCR扩增，各段PCR扩增产物约为1 kb。如图5所示，成功扩增获得CH-HK-2021毒株全基因组，利用SeqMan对测序信息进行组装，即获得CH-HK-2021毒株全基因组序列信息，基因组全长除去poly（A）尾后为28034 bp。CH-HK-2021毒株与PEDV参考株在全基因组水平上的核苷酸序列相似性为96.0%～98.9%，其中，与JS-HZ2012（KC210147）毒株的相似性最高（98.9%），与SM98（GU937797）毒株的相似性最低（96.0%）。在S基因水平上，CH-HK-2021毒株与CH/JX/01（KX058031）毒株的核苷酸序列相似性最高（99.0%），而与经典毒株AVCT12（LC053455）的核苷酸序列相似性仅为93.1%。

全基因组遗传进化分析结果表明，CH-HK-2021毒株属于G2a变异株，与美国及我国部分重组毒株的亲缘关系较近，但与经典毒株AVCT12（LC053455）的亲缘关系较远（图6-A）。基于S基因核苷酸序列的遗传进化分析结果表明，CH-HK-2021毒株位于G2a亚群，与CH/JX/01（KX058031）毒株的亲缘关系最近，但与经典毒株CV777（AF353511）等的遗传进化关系相对较远，同时G2a亚群的大多毒株为我国2010年后的流行毒株（图6-B）。可见，分离获得的CH-HK-2021毒株属于G2a变异株，为我国当前的流行毒株。

2.5 G2a毒株与G2b变异株的S基因比对分析结果

进一步选取GenBank已公布的部分G2a毒株与G2b变异株代表的S基因进行比对分析，结果表明，G2a毒株与G2b变异株在S基因上存在42个核苷酸差异位点，其中，S1亚基包含10个核苷酸差异位点，S2亚基包含32个核苷酸差异位点。在氨基酸水平上，发现G2a毒株和G2b变异株在S蛋白上存在11个氨基酸差异位点，其中，S1亚基包含3个氨基酸差异位点，S2亚基包含8个氨基酸差异位点（表2）。同时对G2a毒株和G2b变异株的S蛋白进行抗原性比较分析，结果显示，二者的S蛋白抗原性差异位点有6处，其中S2亚基包含4处抗原性差异位点（图7）。

表2 PEDV G2a毒株与G2b变异株S基因核苷酸及其氨基酸差异位点的比对分析结果Table 2 Comparative analysis of nucleotide and amino acid differential sites between PEDV G2a and G2b variant strains in S gene

当前，PED依然是影响我国养猪业的主要病害之一（焦点等，2018b；
常新见等，2020），而疫苗接种是防控PED的重要手段。PEDV流行株分离是研发疫苗的重要环节，但PEDV的体外分离培养极其困难，究其原因主要是：（1）体外细胞培养体系与仔猪肠道内环境不同，毒株本身不能适应体外的细胞培养环境；
（2）猪肠道内含有大量毒素，细胞培养过程中大量的毒素极易导致细胞死亡或状态变差，进而导致病毒体外分离失败（Shibata et al.，2000）；
（3）一般情况下病毒体外培养需额外添加胰酶，在胰酶作用下某些细胞无法很好地贴壁或细胞状态变差，而导致病毒分离失败。Pan等（2012）从33份PEDV阳性样品中分离获得1株PEDV，且该毒株在Vero细胞上盲传7代才开始出现细胞病变。本研究从3份新鲜的仔猪肠道组织样品中成功分离获得1株PEDV G2a变异株，该毒株在Vero细胞上盲传至第6代才开始出现细胞病变。但Hofmann和Wyler（1988）曾报道在Vero细胞上培养第1代PEDV即可观察到细胞病变的出现；
Kusanagi等（1992）研究证实PEDV分离株传代至第2代即出现细胞病变，后续的传代过程中细胞病变更加明显。可见，细胞病变差异可能与毒株对细胞的易感性不同有关。

遗传进化分析结果显示，当前的PEDV主要分成经典毒株（G1）和变异株（G2），同时G2群毒株可进一步分成G2a亚群和G2b亚群。这与国内大部分研究结果相似，说明目前国内的PEDV是以变异株为主（焦点等，2018a；
Tian et al.，2021）。本研究分离获得的PEDV流行株属于G2a亚群的变异株，与国内CH/JX/01毒株的亲缘关系最接近。2010年底国内暴发PED，甚至已接种疫苗的规模猪场也未能幸免（Sun et al.，2012）。为此，国内许多科研机构及相关学者针对变异株导致的PED疫情迅速开展PEDV疫苗研发工作，但目前疫苗免疫效果并不理想。究其原因主要是PEDV变异株各亚群间的交叉保护效果有限，而无法获得理想的免疫保护效果。S蛋白是PEDV最大的结构蛋白，在诱导宿主产生中和抗体和病毒入侵方面发挥着重要作用。本项研究对PEDV G2a毒株和G2b变异株间的S蛋白氨基酸差异位点及抗原性差异进行比对分析，结果发现主要的差异位点位于S2亚基上，与Zhao等（2018）、Kang等（2021）的研究结论相似，即S2亚基含有PEDV重要的中和表位。此外，本研究发现PEDV S蛋白S2亚基含有的抗原性差异位点较S1亚基多，当前G2b变异株疫苗免疫效果不理想可能与S2亚基变异导致抗原性差异有关。本课题组前期研究分离获得G2b变异株AH2012/12，并构建了对应的感染性克隆（Peng et al.，2022）。因此，以G2b变异株AH2012/12为骨架，将CH-HK-2021毒株的S2亚基置换AH2012/12毒株的S2亚基，可构建获得同时抗G2a和G2b变异株的候选疫苗毒株。

分离获得的CH-HK-2021毒株属于PEDV G2a变异株，为我国当前的流行毒株，与PEDV经典毒株的亲缘关系相对较远。G2a毒株和G2b变异株在S2亚基上存在多处抗原性差异位点，故推测S2亚基是导致G2a毒株与G2b变异株抗原性差异的主要原因。