不同形态氮肥降低菜心吸收累积环丙沙星（CIP）的生理生化机制

杜明慧，成玉婷，吴小莲，霍锦林，何子豪，陈永骥，何坤航，洪文泓，王海龙

(1. 佛山科学技术学院食品科学与工程学院，佛山 528000；
2.湖南郴电国际发展股份有限公司，郴州 432000；
3. 佛山科学技术学院环境与化学工程学院，佛山 528000)

抗生素在动物养殖业中用于促进动物生长和提高饲料利用率[1-2]，使用后在动物体内只有少量被代谢，大部分（70%～80%） 随粪尿排出[3-5]进入环境中，导致环境中抗生素污染。抗生素可通过污水灌溉，粪肥施用等措施进入土壤，造成土壤中抗生素污染[6]，特别是喹诺酮类抗生素在华南地区土壤中普遍检测出[7]，其检测结果发现农田土壤中喹诺酮类抗生素检出率达97%以上，且单个化合物含量在0～42.0 μg·kg-1之间[8]。抗生素及其降解产物能被土壤中蔬菜等吸收和累积，目前已有报道胡萝卜[9]、莴苣[10]、甘蓝[9]、玉米和菜豆[11]、菜心[12]等蔬菜能不同程度吸收抗生素，从而导致抗生素在植物可食部分进行累积并通过食物链进入人体内进而对人体健康造成潜在危害。抗生素会对植物产生刺激/有害作用[7]。例如环丙沙星（Ciprofloxacin, CIP）通过抑制呼吸电子传递链中的正常电子流动而产生过氧化氢（H2O2），从而导致对光合作用系统的刺激/有害作用[1]。因此，降低植物对抗生素的吸收有利于规避植物毒害和食品安全问题。

氮肥作为肥料用来促进作物生长，可改变植物生理生化特性[13]，如杜永成等[14]实验结果表明氮肥（硝酸钙）可以直接提高甜菜的硝酸还原酶活性、叶绿素含量和光合速率等生理生化指标，从而提高甜菜的生物量。同时，氮肥还可以改变土壤中污染物的生物有效性，从而影响植物对污染物的吸收和累积作用。早期，Willaert 等[15]发现使用氮肥可以改变菠菜对Cd 的吸收。目前，常见的氮肥形态有酰胺态氮肥、硝态氮肥和氨态氮肥等[16]，植物对各种形态的氮肥利用率不同，其植物生理生化势必也存在显著差异，从而导致了植物对污染物吸收累积差异[16]。如施加铵态氮肥比施加硝态氮肥更显著增强菠菜对Cd 的吸收[15]。Meng 等[12]前期的研究证实氮肥可以有效减少菜心对环丙沙星的吸收和累积作用，并从分子生物学的角度系统揭示了其作用机制，高 NO3-供应量可降低两种菜心对CIP 的吸收速率和亲和力，从而降低了菜心对CIP 的吸收积累。然而, 污染物在植物体内的吸收和累积过程除了分子生物学作用机制以外，植物生理生化机制对菜心吸收和累积抗生素也会产生重要影响[17]。因此，基于这种假设，本研究在前期基础上进一步探究了氮肥介导下植物吸收和累积环丙沙星的生理生化机制，以期为揭示氮肥影响植物吸收和累积污染物的植物生理与分子生物学奠定基础。

1.1 材料

环丙沙星（CIP，纯度＞ 98%），于德国Ehrenstorfer GmbH 公司购买。甲醇、乙腈均为色谱纯，购于Sigma公司，其他化学试剂和药品包括乙酸、硝酸铵、尿素、氯化铵、氰氨化钙、甲醇、硫酸铵等均为分析纯，购自广州化学试剂厂和天津大茂化学试剂厂。实验用水为高纯水。油青四九菜心为课题组前期筛选的CIP 高累积品种[18]，购于广州市佰顺蔬菜研究所。盆栽土取自广州华南农业大学农田土壤试验基地，采集风干、粉碎过10 筛备用。农田土中CIP 背景值为0.071 mg·kg-1，pH 6.2，有机质132.4 g·kg-1，全氮0.79 g·kg-1，全磷1.28 g·kg-1和全钾12.5 g·kg-1。

1.2 方法

1.2.1 盆栽实验方法 污染土壤：根据实际农田土壤中CIP 污染水平设置盆栽土壤中CIP 污染浓度为20.00 mg·kg-1，将CIP 用水溶解后均匀滴入已筛好的土壤中，立即充分搅拌均匀配制污染土壤。加入适量高纯水保持土壤湿润（含水率：50%～60%左右），盖上遮阳布，于室温下避光老化。2 周后装入实验盆（每盆2.5 kg 污染土）中，老化后土壤中CIP实际浓度为19.3 mg·kg-1。设置4 种氮肥形态分别为UR: 酰胺态氮（尿素）、AN: 硝态氮（硝酸铵）、AC:铵态氮（氯化铵）、CC: 氰氨态氮（氰氨化钙），添加不同种类氮肥（用量为160 mg·kg-1）于实验盆中，同时设置未施加氮肥污染土壤 (NF) 和不添加CIP(P) 为对照组，共6 个处理，每个处理3 个重复。

盆栽种子：将菜心种子用过氧化氢（2%）消毒30 min 后，用高纯水冲洗6～8 次，将种子的表面水分用滤纸干燥，均匀撒入盆中（每盆约20 粒），加入一定量高纯水保持种子含水率。待幼苗生长至4 片真叶时逐渐剔苗直至每盆保留4 株长势一致的植株，继续生长，在不同时期取样备测。

1.2.2 样品预处理 植物样品前处理参考文献[19]，准确称取0.500 0 g 已冻干磨碎的样品置于10 mL 离心管中，加入乙腈-乙酸（49.5∶0.5，V∶V）提取液7.5 mL，超声提取30 min，离心（12 000 r·min-1）8 min 收集上清液。根据上述方法，残渣再提取2 次，合并上清液于鸡心瓶中，旋转蒸发至近干，于鸡心瓶中加入1 mL 高纯水，在超声波清洗器中清洗5 次，然后将液体分批次过活化（甲醇和高纯水活化）后的HLB 固相萃取小柱萃取富集（过HLB），待提取液富集完毕用6 mL 高纯水清洗HLB小柱，真空干燥30 min，以6 mL 甲醇洗脱HLB 小柱，收集洗脱液在40 ℃水浴下氮吹至近干，用乙腈-水（2∶8，V∶V）溶液定容至1 mL，过0.22 µm滤膜后备测（于4℃冰箱保存）。

1.2.3 HPLC-MS/MS 分析 CIP 采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定，其测定方法参考文献[19]。色谱条件为Kinetex C18 色谱柱，35 ℃柱温，30 min 柱平衡时间；
质谱条件为电喷雾离子源（ESI+），400 ℃离子源温度，5 500 V毛细管电压；
为保证实验质量，本实验采用内标法，样品测定时，向空白的植物样品中添加10 μg·kg-1环丙沙星标准品。植物样品回收率为 67.4%～88.4%，标准偏差（RSD）小于10%。同时，为保证测定过程的稳定性，每隔20 个样品进行1 次标准工作液校正。

1.2.4 菜心生物量测定 所有菜心样品分为地上部和根部，用蒸馏水洗净、晾干，并用电子天平进行称重记录，最后放至 -80 ℃保存备用。

1.2.5 硝酸还原酶活性测定 在盆栽实验第25 天和第35 天采集菜心叶片，用分光光度计在520 nm处测定OD 值，具体测定方法参照杜永成等[14]的方法。

1.2.6 叶绿素含量测定 盆栽实验完成后参考95%乙醇浸泡法[20]。测定叶片选取大小特征都相似的新鲜菜心叶片2.000 g，洗好擦干并且避开叶脉部分剪碎置于研钵中，向研钵中加入乙醇（95%）并研磨成匀浆进行浸泡至组织变白，再将浸提上清液转移并定容于50 mL 容量瓶。取上清液置于分光光度计，在波长649 和665 nm 处测定其吸光度。计算得出叶绿素a 和叶绿素b 的含量。

1.2.7 叶绿素荧光诱导动力曲线 当盆栽实验进行到第47 天时，采用手持植物效率仪（PEA）测定实验各处理菜心叶片叶绿素快速荧光诱导动力数据。每个处理选取10 片菜心叶片避开叶脉区进行测定。测定前首先将叶片进行暗适应20 min，然后采用Handy PEA 发射饱和脉冲光（3 000 μmol·m-2·s-1）使叶片暴露1 s 并记录测量如下参数：50 μs 荧光值（O 相，F0）、100 μs 荧光值（K 相，FK）、2 ms 荧光值（J 相，FJ）、30 ms 荧光值（I 相，FI）和最大荧光值（P 相，FM），具体方法参照Tomar 等[21]，利用JIP-test 分析获得O-J-I-P 荧光诱导曲线[22]。

1.3 数据处理与分析

运用Excel 2018、Origin 8.5.1 和Word 2018 进行数据统计及图表绘制，SPSS 19.0 进行数据统计分析。

2.1 菜心生物量

植物受污染物胁迫产生毒害作用时，生物量变化被认为最直接的指示物[23]。本研究发现（图1），环丙沙星污染（NF）显著降低菜心的生物量（相比对照P 处理降低35.7%），表明CIP 可抑制菜心生长[24-25]。这可能是由于CIP 在一定程度上抑制菜心的光合作用和呼吸作用途径，引起植物毒性和刺激效应[1]，从而抑制了菜心生长。

在环丙沙星胁迫下，与未施加氮肥的相比，施加氮肥显著提高菜心生物量，其生物量相对于NF处理提高了54.3%～72.3%。结果说明氮肥能有效缓解环丙沙星对菜心的胁迫毒害效应。这一方面可能是由于氮素进入土壤后与土壤中污染物形成了植物竞争吸收关系，抑制了植物对污染物的吸收，从而降低了污染物对植物的胁迫效应，进而促进了植物生长[12,26]；
另外一方面氮素作为植物生长的主要营养物质，吸收后的氮素在植物体内迅速被同化，植物生物量显著提高，进而稀释了污染物对植物的胁迫效应[27]。

不同形态氮肥对菜心生物量的影响存在显著差异，不同形态氮肥下菜心生物量大小依次为：酰胺态氮（65.8 g）＞硝态氮（61.4 g）＞铵态氮（44. 8 g）＞氰氨态氮（40.0 g）。这一结果与前人[16,28-29]研究的结果一致，硝态氮和酰胺态氮能显著促进小麦、大青叶的生长，这可能是由于植物对不同形态氮素的吸收利用差异导致的。酰胺态氮加入土壤后，会被土壤中的脲酶水解成植物可以吸收利用的NH4+-N，进而避免了直接施用过量铵态氮肥短期内对植物产生的胁迫现象[30]。

处理硝态氮中的硝酸根离子易溶于水且带负电，故难以被土壤胶体吸附固定于土壤中，因此容易被植物吸收[31]。此外，不同作物对不同形态的氮素有偏好，例如，旱生植物喜好硝态氮肥[30]。结果说明，可通过使用不同形态氮肥有效调节土壤中环丙沙星的毒害效应。

2.2 叶片硝酸还原酶活性

植物叶片中的硝酸还原酶（Nitrate reductase，NR）是植物氮素同化的关键酶，也是一种诱导酶，与作物吸收和利用氮素有关[32]。本研究发现，在种植25 d 和35 d 时，暴露在CIP 污染土壤中菜心叶片中NR 的活性显著低于无污染对照处理，其NR 活性分别为120.8 和129.3 μg·g-1·h-1（图2），说明CIP 抑制了菜心叶片中NR 活性，进而可能影响菜心吸收和利用氮素。施用氮肥能显著缓解CIP 对叶片NR 活性的抑制，种植25 d 时，施用氮肥后叶片中NR 活性范围为125.7～128.0 μg·g-1·h-1；
种植35 d 时，施用氮肥叶片中NR 活性范围为149.4～160.4 μg·g-1·h-1。说明种植时间越长，氮肥发挥的作用越大。

不同形态氮肥处理下，种植25 d 时NR 活性无显著性差异。但种植35 d 时NR 活性显著性差异。种植35 d 时，不同形态氮肥处理下叶片中NR 活性大小依次为硝态氮（160.4 μg·g-1·h-1）＞ 酰胺态氮（158.6 μg·g-1·h-1）＞铵态氮（149.7 μg·g-1·h-1）＞ 氰铵态氮（149.4 μg·g-1·h-1）。结果与施用氮肥后生物量特征（图1）呈相似规律，说明植物对不同形态氮肥的利用不同，且氮素利用过程其诱导的NR 活性也不同。有研究表明，不同氮肥形态通过诱导NR活性来改变下游信号传导过程，例如NO3-诱导植物中NR 活性的增加，NH4+显著抑制NR 活性[33]，从而改变植物中基因表达、解毒及抗氧化系统等过程，进而影响植物对污染物的吸收[34]。例如，NO3-增加遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）和水稻体内的Cd 的吸收和积累[35-36]，而NH4+和尿素降低水稻对Cd 的吸收和积累[36]。因此，不同形态氮肥处理诱导的NR 活性的变化可能是导致植物吸收累积CIP 差异的一个重要因素。

2.3 叶片中叶绿素含量

植物叶片中叶绿素含量状况是反映其光合能力的重要指标之一，并与净光合强度呈显著正相关关系[37]，从而影响植物生长及植物对污染物的吸收累积能力。CIP 污染会显著降低菜心叶片中叶绿素a与叶绿素b 含量，与对照（处理P）相比，分别下降20.3%和24.2%（图3）。这可能是因为CIP 与相关酶作用抑制叶绿素前体的合成，同时通过提高细胞中叶绿素酶的活性促进叶绿素分解或直接破坏叶绿体结构，而降低植物体内叶绿素的含量。

施加氮肥能显著提高菜心叶片的叶绿素a 与叶绿素b，其含量范围分别为0.720～0.786 和0.110～0.144，甚至高于无污染组（处理P）。说明施用氮肥能显著缓解CIP 对叶绿素的抑制作用，促进叶片光合作用的进行，进而促进植物生长。其结果与李维等[38]的实验结果一样，施氮肥有效提高茶树叶中绿素a、b 含量。魏花朵等[39]表明氮肥有效地缓解Cd 胁迫对结缕草叶片光合系统的损害，促进植物叶片叶绿素的合成。这可能是由于氮肥中的氮素有助于保持叶绿素含量的平衡，促进Cd 胁迫下类囊体膜蛋白复合体的组装和稳定，增强水的光解和电子传递的速率[40-41]，提高光能的捕获和转换能力，从而降低叶绿体受到污染物胁迫的毒害作用。不同形态氮肥对菜心叶片中叶绿素含量的影响不同，其中施加酰胺态氮和硝态氮显著提高了菜心叶片中叶绿素a 和叶绿素b 含量，即酰胺态氮（叶绿素a: 0.765± 0.079，叶绿素b: 0.144 ± 0.023），硝态氮（叶绿素a: 0.786 ± 0.021,叶绿素b: 0.137 ± 0.007）。这与卞赛男等[42]的实验结果相似，硝态氮处理下叶绿素相对含量高于铵态氮处理。不同形态氮肥对叶绿素含量的影响差异可能是不同氮素形态对光合作用电子传递、光能捕获和转换能力等协调能力差异导致[43]。菜心叶片中叶绿素（a 和b）含量差异直接导致植物生长的差异，从而影响菜心对CIP 吸收累积能力的差异。

2.4 荧光动力曲线

当光合系统受到污染物胁迫时，其叶片叶绿素在叶绿体光合系统Ⅱ（PSⅡ）供体侧、受体侧化合物氧化还原状态和电子传递过程受到影响[44]，导致叶绿体荧光曲线发生相应改变。叶片避光处理后的最小的初始荧光值是F0值，当该值显著增加时，PSⅡ反应中心易受影响。叶片暗反应后最大荧光值是Fm值，当Fm值显著降低时，说明光合作用电子传递链受体侧受到严重损伤。

与无污染组相比，施加环丙沙星后其荧光值F0上升，Fm（叶片暗反应后最大值）下降（图4），此时PSⅡ中电子传递链受体受到严重损伤，说明CIP干扰或破坏菜心光合作用电子传递过程[21,44]。施加氮肥后，与污染组（NF）相比，Fm均呈现上升趋势，且在OJIP 荧光动力学曲线均表现为在O 相F0值和P 相Fm值呈现上升的趋势，说明在氮肥能有效缓解CIP 对菜心叶片PSⅡ中电子传递链的干扰和破坏。在不同氮肥形态处理下，在OJIP 荧光动力学曲线均表现为在O 相F0值和P 相Fm值呈现上升的趋势，其增幅总体随氮肥形态而不同，其硝态氮处理下最大，且Fm值最高，其次分别为酰胺态氮、铵态氮、氰铵态氮，说明荧光动力学参数表明硝态氮和酰胺态氮能阻碍CIP 抑制菜心的光合作用活性主要是降低初级光化学过程损伤，进而能显著促进菜心的光合作用性能。

为更深入解析不同氮肥形态对叶绿体光合作用的影响，通过从OJIP 动力学曲线中推导菜心叶片光系统II（PS II）的15 个生物物理学参数行为（图5）。不同形态氮肥对菜心叶片叶绿素荧光参数影响不同，其中最终受体PSI 中单位横截面积电子受体的减少值（RE0/CS）、基于叶片横截面光合性能参数（Pics）、单位叶片横截面电子传递通量（ET0/CS0）、电子传递链还原势（Sm）和基于反应中心的光合性能参数（PIabs）总体比对照相关参数值高，该结果表明氮肥的施加会增强光合系统中能量吸收、光能捕获或 QA 电子转移，且酰胺态氮肥与硝态氮肥处理相对其他形态氮肥处理对叶片叶绿素荧光参数增幅较为显著，说明酰胺态氮和硝态氮增强了菜心光合系统中电子转移链活性，增加叶片横截面电子传递通量的效果最为明显，同时且Sm值表明硝态氮和酰胺态氮减弱了CIP 对菜心叶片总电子受体容量的胁迫，该容量是衡量 PS II 和 PS I 受体侧间电子转移量的重要标准[45]。

2.5 菜心中CIP 含量特征

不施用氮肥处理中菜心地上部中CIP 含量为191.1 μg·kg-1，当施用氮肥后，菜心地上部中CIP含量均显著降低，其比对照组降20.7%～62.0%（图6(a)）。说明氮肥显著降低了菜心地上部对CIP 的累积。在不同形态氮肥处理下，菜心地上部中CIP 含量依次为酰胺态氮（72.7 μg·kg-1）＜铵态氮（92.7 μg·kg-1）＜硝态氮（131.1 μg·kg-1）＜氰氨态氮（151.5 μg·kg-1）。说明不同形态氮肥对作物吸收累积污染物的影响不同，王朋超[46]也发现中高浓度的酰胺态氮肥能使水稻籽粒中Cd 含量降低66.27%。Jalloh 等[36]发现不同形态氮肥处理下水稻中Cd 含量大小依次为铵态氮＜酰胺态氮＜硝态氮，然而小白菜可食部分中Cd 含量大小却出现相反的规律[47]，即铵态氮＞酰胺态氮＞硝态氮。尽管不同形态氮肥对植物积累污染物的影响结果并不一致，但表明了氮肥形态可以对植物吸收污染物含量产生较大的影响。

不施用氮肥处理中菜心根部CIP 含量为446.1 μg·kg-1，当施用氮肥后，根部中CIP 含量均显著降低，其比对照组降低8.97%～34.7%。不同形态氮肥处理下，根系中CIP 含量特征与地上部中含量特征相似，即酰胺态氮（291.3 μg·kg-1）＜铵态氮（329.5 μg·kg-1）＜硝态氮（337.0 μg·kg-1）＜氰氨态氮（406.1 μg·kg-1）。由此可见，氮肥能降低菜心组织中CIP的残留，特别是酰胺态氮肥能显著降低菜心地上部和根部中CIP 的含量。前面研究发现酰胺态氮肥处理下菜心具有更高的生物量（图1），这表明该处理下菜心对CIP 具有更高的“容量”，进一步说明酰胺态氮肥具有更大的CIP 修复潜能。

通过对菜心生物富集系数（BCF）和转运系数（TF）进行分析，结果发现与未施加氮肥相比，施加4 种氮肥均降低了根部BCF（除氰氨态氮外）和茎叶TF（表1），与对照相比最高分别降低25%和41.7%，说明施肥可抑制CIP 在菜心根系吸收和茎叶转运能力。这一结果在课题组Meng 等[12]前期的另外一篇报道中已被证实。将不同形态氮肥处理下根部BCF 进行对比，除氰氨态氮处理下的BCF 与对照相比无显著差异，其他3 种形态氮肥处理下BCF 均显著低于对照，且这3 种处理之间无显著差异。4 种形态氮肥处理下TF 均显著低于对照，其中酰胺态氮和铵态氮处理下TF 显著低于硝态氮和氰氨态氮处理。由此可见，不同形态氮肥处理对菜心吸收和转运CIP 能力的影响不同，其中同时显著降低BCF 和TF 的处理为酰胺态氮和铵态氮。这一结果与杨锚等[48]和Zhan 等[49]的研究结果一致，施用酰胺态氮和铵态氮肥显著降低水稻土中镉的转运及减少小麦和莴苣对菲的富集系数和转运系数。

表1 不同处理下菜心对CIP 的富集系数和转移系数Table 1 BCFs and TFs of Brassica parachinensis L. for CIP under different forms of nitrogen fertilization treatment

导致BCF 和TF 差异的原因可能是由于不同形态氮肥对土壤理化性质的影响不同，从而导致了污染物在土壤中的赋存状态及植物生长的差异，最终影响了污染物在植物体内的吸收和转运[50]。前面讨论中发现不同形态氮肥对植物的光合作用影响不同，植物的光合作用过程与污染物的吸收和累积有着密切联系，Zhao 等[22]表明光合作用增强能提高菜心对DBP 的耐受性，同时促进菜心对DBP 的吸收累积作用。同时，有研究表明酰胺态氮肥能显著降低水稻叶片的叶片气孔导度和根系传导率，从而降低水稻光合作用速率，进而通过降低蒸腾速率抑制水稻对Cd 的吸收转运过程[51]。前面研究发现酰胺态氮肥能显著促进菜心的光合作用性能（图4 和5），但该处理下对降低菜心中CIP 的BCF 和TF 最为显著（表1），这表明酰胺态氮肥对菜心吸收和转运CIP 的影响机制与重金属的影响机制并不一致，这需要在后期实验中深入研究。此外，分子调控机制也可能是造成不同形态氮肥对菜心吸收累积CIP 差异的原因之一，例如，NO3-能够刺激贴转运基因（LeIRT1）在番茄（Solanum lycopersicum）中的表达，进而促进了Cd 的积累[52]。也有研究发现酰胺态氮肥参与水稻根部OsNramp1和OSHMA2基因对Cd 吸收和积累的调控，同时通过调控OsNramp5基因来控制水稻对Cd 的吸收和转运[53]。然而目前并没有获取更多的数据来支撑这一观点，这有待于后期进一步深入研究。

不同形态氮肥对CIP 暴露下的菜心生理生化产生显著影响，特别是酰胺态氮肥对菜心的生物量、硝酸还原酶活性、叶绿素含量。

施加氮肥能促进光合作用电子传递过程和提高叶片光合作用性能，进而促进作物生长，其中酰胺态氮肥对菜心光合作用的影响最为显著。

施加氮肥可以降低菜心对CIP 的吸收和转运，酰胺态氮（尿素）和铵态氮（氯化铵）能有效降低菜心对CIP 的吸收累积。