基于VIP-cAMP-PKA-AQP8通路探讨痛泻要方对腹泻型肠易激综合征的治疗机制

李贺元 陈伟刚 熊阿琴 张雁

肠易激综合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是临床常见的一种胃肠道功能紊乱性疾病，患者多表现为腹痛、腹部不适、大便性状改变等症状，给身心健康和日常生活质量带来不利影响。根据罗马Ⅲ诊断标准，IBS 可分为腹泻型（IBS-D）、便秘型（IBS-C）、交替型及不确定型，其中以IBS-D 最为常见。有研究指出[1，2]，水通道蛋白-8（Aquaporin-8，AQP8）表达减少与IBS-D 患者腹泻、便秘等临床症状有关，而血管活性肠肽（Vasoactive intestinal peptide，VIP）可通过调控细胞蛋白激酶系统（PKA-cAMP 通路）改变AQP8含量，进而促进IBS-D 的发生发展。在临床治疗方面，目前西医对于IBS-D 尚无特效药物，主要以饮食干预、对症治疗等方式为主，但存在疗程长、病情反复发作等缺点。痛泻要方是临床治疗IBS-D 的常用中药处方，可有效促进小肠吸收功能恢复，改善患者临床症状[3]。有动物实验研究发现[4]，痛泻要方治疗IBS-D 的机制可能与结肠中水通道蛋白含量改变密切相关。为此，本研究基于VIP-cAMP-PKA-AQP8通路探讨痛泻要方对IBS-D 的治疗机制，以期为IBS的相关研究提供理论依据。

1.1 一般资料选取2020年7月～2021年8月在我院治疗的106 例IBS 患者为研究对象，根据罗马Ⅲ诊断标准和IBS 亚型分型标准将其分为IBS-D 组（n=74）和IBS-C 组（n=32）。IBS-D 组中男31 例，女43 例；
年龄23～64 岁，平均（43.61±5.73）岁；
体质指数（BMI）19.4～27.1kg/m2，平均（23.41±2.29）kg/m2。IBS-C组中男13 例，女19 例；
年龄25～63 岁，平均（42.98±6.04）岁；
BMI 19.8～26.7kg/m2，平均（23.21±2.06）kg/m2。同期选取30 例健康志愿者作为健康对照组，其中男13 例，女17 例；
年龄25～64 岁，平均（42.47±5.91）岁；
BMI 19.5～26.9kg/m2，平均（23.36±2.11）kg/m2。三组研究对象性别、年龄、BMI 等基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 纳入与排除标准IBS 患者纳入标准：①符合罗马Ⅲ诊断标准和IBS 亚型分型标准[5]；
②IBS-D 患者符合《肠易激综合征中医诊疗共识意见》中肝郁脾虚证的中医辨证诊断标准[6]；
③年龄18～65 岁；
④临床资料齐全；
⑤患者及家属对治疗方式、检查项目等知情同意；
⑥依从性良好。排除标准：①器质性病变者；
②其他原因导致的非功能性肠病者；
③心、肝、肾、血液、脑部等重要脏器或系统患有严重疾病者；
④精神疾病或严重意识障碍者；
⑤过敏体质或对本研究用药过敏者；
⑥妊娠期或哺乳期女性。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR 检测AQP8 mRNA、VIP mRNA 表达三组研究对象均行结肠镜检查，并在降结肠取标本2 份，标本取得后快速放入液氮罐中保存待测。从液氮罐中取出标本，按50mg 标本：1ml TRIzol 溶液的比例加入TRIzol 溶液（购置于美国Ambion 公司）。随后按照TRIzol 说明书提取组织RNA，将提取出的RNA 逆转录为cDNA，并取cDNA 进行RT-PCR。AQP8 反应体系为：SYBR Premix Ex Taq（购置于日本TaKaRa 公司）10μl，上游引物、下游引物各0.8μl（上游引物：5"-TCATTGGAGTGGGAAGACC-3"，下引物：5"-TGAGAAGCAAGGAAGTGGC-3"），cDNA 2.0μl，二次蒸馏水6.4μl；
反应条件为：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 20s，40 个循环。VIP 反应体系为：SYBR Pre mix Ex Taq（购置于日本TaKaRa 公司）10μl，上游引物、下游引物各0.2μl（上游引物：5"-TAATGGTGG ACCGCAACAAC-3"，下游引物：5"-GTGAGCACTGAAG CGAAAGC-3"），cDNA 2.0μl，二次蒸馏水7.2μl；
反应条件为：94℃ 45s，60℃ 30s，72℃ 60s，35 个循环。最后计算CT 值和溶解曲线，获取AQP8 mRNA、VIP mRNA 的相对表达量。

1.3.2 免疫组化法检测蛋白激酶A（PKA）表达 将取得的组织标本固定、切片后以3%过氧化氢溶液孵育10min，随后采用磷酸盐缓冲液冲洗3 次，每次5min，封闭后在温室下孵育30min。依次加入一抗（1:400）、二抗（1:5 000），并以磷酸盐缓冲液冲洗3次，经DAB 显色后封片，于光镜下观察。

1.3.3 放射免疫法检测环磷酸腺苷（cAMP）表达 将50mg 组织标本加入冰醋酸、无水乙醇混匀后静置5min，以3 500r/min 的条件离心处理15min，取上清液保存。随后将残渣加入75%乙醇，匀浆分散，再以3 500r/min 的条件离心处理15min，再合并上清液进行检测。检测过程严格按照cAMP 试剂盒说明书执行。

1.3.4 治疗方法 74 例IBS-D 患者均给予中药痛泻要方治疗，具体用药方案：基本方为炒白术20g、陈皮12g、防风10g、白芍20g；
兼肝郁者加用柴胡、香附；
脾虚甚者加茯苓、炒山药、砂仁；
兼有肾阳虚者加五味子、肉豆蔻、补骨脂；
痛甚者加延胡索、白芍加至30g；
心神不安者加合欢花、合欢皮、夜交藤。上述所有药物均由本院煎药室统一熬成汤剂，每剂药物取汤汁300ml，分装2 袋，早晚空腹各服用1袋，连续治疗1 个月。

1.4 评价指标①比较三组研究对象结肠黏膜AQP8 mRNA、VIP mRNA 表达水平，并分析AQP8、VIP 基因表达的相关性。②比较IBS-D 患者治疗前后AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 以及cAMP 表达水平。③治疗1 个月后，参考《肠易激综合征中医诊疗共识意见》对IBS-D 组患者进行疗效评估。治疗后患者症状、体征消失，证候积分减少幅度≥90%，判定为痊愈；
治疗后患者症状、体征明显改善，证候积分减少幅度为60%～89%，判定为显效；
治疗后患者症状、体征有所好转，证候积分减少幅度为30%～59%，判定为有效；
未达上述标准者，判定为无效。比较不同疗效患者AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA、cAMP 表达水平，并分析临床疗效与各指标的相关性。

1.5 统计学方法采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据处理，计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；
相关性分析采用Pearson 检验；
以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 三组研究对象AQP8 mRNA、VIP mRNA 表达水平比较IBS-D 组AQP8 mRNA 表达水平低于IBS-C 组和健康对照组，VIP mRNA 表达水平高于IBS-C 组和健康对照组；
IBS-C 组AQP8 mRNA、VIP mRNA 表达水平均高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 三组研究对象AQP8 mRNA、VIP mRNA 表达水平比较（±s）

表1 三组研究对象AQP8 mRNA、VIP mRNA 表达水平比较（±s）

注：与健康对照组比较，*P＜0.05；
与IBS-C 组比较，△P＜0.05

组别 n AQP8 mRNA VIP mRNA IBS-D 组 74 0.58±0.16△* 6.94±2.17△*IBS-C 组 32 1.25±0.32* 6.01±1.93*健康对照组 30 0.91±0.22 2.39±0.89 F 3.974 4.264 P 0.018 0.011

2.2 AQP8 mRNA 与VIP mRNA 表达的相关性Pearson 相关性分析显示，AQP8 mRNA 与VIP mRNA 的表达量呈负相关（r=-0.534，P=0.000）。见图1。

2.3 IBS-D 组患者治疗前后AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表达水平比较治疗后，IBS-D 组患者AQP8 mRNA 表达水平高于治疗前，VIP mRNA、PKA、cAMP 表达水平低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 IBS-D 组患者治疗前后AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表达水平比较（±s）

表2 IBS-D 组患者治疗前后AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表达水平比较（±s）

时间 n AQP8 mRNA VIP mRNA PKA cAMP治疗前 74 0.58±0.16 6.94±2.17 0.78±0.25 0.54±0.22治疗后 74 0.84±0.24 4.65±2.03 0.42±0.13 0.31±0.15 t 7.754 6.629 10.990 7.431 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 不同疗效患者AQP8 mRNA、VIP mRNA 、PKA及cAMP 表达水平比较IBS-D 组患者服用痛泻要方治疗1 个月后，痊愈23 例，显效27 例，有效18例，无效6 例，治疗有效率为91.9%。不同疗效患者AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同疗效患者AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表达水平比较（±s）

表3 不同疗效患者AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表达水平比较（±s）

疗效 n AQP8 mRNA VIP mRNA PKA cAMP痊愈 23 0.96±0.29 3.27±1.05 0.23±0.09 0.21±0.07显效 27 0.81±0.35 4.59±2.23 0.39±0.11 0.29±0.10有效 18 0.63±0.25 5.65±2.07 0.59±0.20 0.37±0.16无效 6 0.51±0.21 6.04±1.94 0.68±0.26 0.52±0.08 F 5.136 10.256 7.461 9.577 P 0.007 0.000 0.000 0.000

2.5 AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA 及cAMP 表达水平与疗效相关性Pearson 相关性分析显示，AQP8 mRNA 表达与疗效呈正相关（r=0.671，P=0.007），而VIP mRNA、PKA、cAMP 表达与疗效呈负相关（r=-0.423、-0.545、-0.397，P=0.011、0.010、0.023）。

近年来，随着社会经济的快速发展以及人们饮食习惯的改变，IBS 发病率逐年升高，给患者生活、学习、工作、社交等带来了极大影响。有报道指出[7]，我国IBS 临床发病率为5.6%～11.5%，而在消化科门诊患者中占比高达10.7%～34.3%。在中医学上，IBS 属于“腹痛”、“泄泻”之范畴，其发病与外邪入侵、情志失调、体质虚弱、肠道失润等有关。古籍《素问·举痛论》云：“寒邪客于小肠，小肠不得成聚，故后泄腹痛矣”，认为饮食不节、腑脏虚弱导致气机郁滞，进而通降功能失调，脾失健运而出现腹部不适等症状。因此，在治疗方面当以“疏肝健脾、渗湿止泻”为原则。痛泻要方是以炒白术、陈皮、防风、白芍为基础方的加味中药处方，辅以柴胡、茯苓、炒山药、五味子、肉豆蔻、补骨脂等药物可以发挥调和肝脾之功效。本研究中，IBS-D 组患者服用痛泻要方治疗1 个月后，治疗有效率为91.9%，与刘小军等[8]研究结果相近。

目前，尽管痛泻要方治疗IBS 的临床效果已得到诸多临床研究证实和肯定[9，10]，但关于痛泻要方对IBS 的具体作用机制研究较少。IBS-D 作为最常见的一种IBS 分型，其发病因素和机制较为复杂，有研究指出[11]，经神经-内分泌-免疫系统导致的水代谢异常和肠道平滑肌运动障碍是导致IBS-D腹泻、腹痛的主要因素。水通道蛋白（AQPs）是一类结构、功能相似的膜蛋白，其成员AQP1、AQP3、AQP8 等均与肠道水运输密切相关。Zhao 等[12]研究指出，AQPs 含量的改变可通过影响肠道水液代谢和水运输过程，进而促使IBS-D 患者腹泻症状加重。另外，也有研究证实[13]，AQP8 在人结肠黏膜广泛表达，该蛋白的下调可损害活性结肠炎中的水分吸收，导致水样腹泻的发生。本研究结果显示，IBS-D 组患者AQP8 mRNA 表达低于IBS-C 组和健康对照组，而IBS-C 组AQP8 mRNA 表达高于健康对照组。由此可见，AQP8 mRNA 表达降低，水分吸收减少，患者表现出腹泻症状，AQP8 mRNA 表达增加，水分吸收增加，患者表现出便秘症状，与邱侣侣等[14]研究结果一致。

AQP8 表达调控的相关研究表明[15]，VIP 是调控AQPs 的重要神经递质，其可直接调控人结肠上皮AQP8 的表达，影响水运输环节。在本研究中，Pearson 相关性分析显示，VIP mRNA 与AQP8 mRNA 表达水平呈负相关，提示VIP mRNA 表达降低可调节AQP8 蛋白含量升高，进而改善肠道水液代谢异常。此外，在有关VIP 调控AQP8 表达的信号途径方面，近年来有研究认为[16，17]，VIP 可能是介导cAMP-PKA 信号通路参与了AQPs 表达的调控，进而维持机体水代谢稳态，促进IBS 患者症状改善。AQPs 均含有PKA 磷酸化的同源序列，这些AQPs上的丝氨酸受磷酸化作用后可调节AQPs 的运输、门控，从而改变膜的水通透性。VIP 属于一种神经调节肽，对胃肠道的运动和分泌功能具有调节作用，其可与G 蛋白耦联跨膜受体结合，进而激活腺苷酸环化酶，促进cAMP 的释放。cAMP 的增加可活化PKA，进而催化AQPs 上的丝氨酸磷酸化，增加膜的水通透性。

痛泻要方是治疗IBS-D 的常用处方，本研究分析了痛泻要方对IBS-D 的药理机制。许惠娟等[18]研究表明，痛泻要方可能通过VIP 途径提高AQP8的表达而发挥治疗功效。本研究结果显示，治疗后IBS-D 组患者AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA、cAMP 表达与治疗前比较差异均有统计学意义，且AQP8 mRNA 表达与疗效呈正相关，而VIP mRNA、PKA、cAMP 表达与疗效呈负相关。上述结果提示痛泻要方对IBS-D 患者机体AQP8 mRNA、VIP mRNA、PKA、cAMP 表达有明显影响，其药理机制可能与VIP-cAMP-PKA-AQP8 通路有关。

综上所述，IBS 患者症状与AQP8 mRNA、VIP mRNA 表达密切相关，痛泻要方可能是基于VIPcAMP-PKA-AQP8 通路发挥其药理作用，实现改善患者临床症状的治疗目标。