宫颈癌的相关免疫治疗及进展

尹博，丁鉴夷，杨美琴，韩凌斐

从世界范围来看，宫颈癌已成为妇女第四大常见的癌症死亡原因，是主要的健康威胁之一[1]。既往研究已证实人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染与宫颈癌密切相关，HPV 筛查和疫苗接种计划是预防疾病的有效策略。多年来，不能进行手术治疗的复发性和晚期转移性宫颈癌患者存在预后差、生存质量严重下降和早期死亡率高等诸多问题[2]。基于此，近年随着肿瘤免疫研究的深入和新基因编辑技术的不断成熟，免疫肿瘤学成为了改善宫颈癌患者预后的潜在新策略。在临床研究中，发现免疫疗法比传统抗肿瘤疗法具有优势，包括免疫检查点抑制剂和过继性T 细胞疗法在内的策略已在对传统疗法无反应的患者产生了积极的客观应答率。根据作用机制的不同，宫颈癌免疫治疗的方法主要包括免疫检查点抑制剂、HPV 相关疫苗、基于树突状细胞（dendritic cell，DC）的免疫治疗和过继性T 细胞免疫疗法等。现综述宫颈癌中免疫疗法的应用及研究进展。

HPV 是宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）和宫颈癌的重要病因。鳞状细胞癌是宫颈癌最常见的组织学类型，其他常见的组织学类型还包括宫颈腺癌和腺鳞癌。研究表明年轻成年女性中HPV 感染的患病率高达40%～80%，而宫颈癌是未解决的HPV 感染的罕见终末期。在流行病学方面，至少有12 种HPV 被归类为致癌的高危（HR）类型（HPV16/18/31/35/39/45/51/52/56/58/66/68），上述HPV16 和HPV18 是最常出现的HR-HPV 类型，并引起约70%的宫颈癌[3]。HPV 是具有221 种鉴定类型的小型非包膜双链DNA 病毒，这些病毒具有8 kb的基因组，可编码早期调节蛋白（E1、E2、E4、E5、E6和E7）和晚期结构蛋白（L1 和L2）。E1 和E2 蛋白调节HPV DNA 的复制和转录；
E4 通过破坏上皮细胞角蛋白来协助病毒释放；
E5 负责诱导宿主细胞中的生长因子；
E6 结合和降解肿瘤抑制基因p53 和促凋亡蛋白BAK；
E7 结合并抑制肿瘤抑制因子pRb。关于晚期基因，L1 和L2 分别编码形成HPV 衣壳的主要和次要结构蛋白[4]。

2.1 免疫检查点抑制剂针对程序性死亡蛋白1（programmed death 1，PD-1）和细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）的免疫检查点抑制剂已经成为众多癌症最有前景的治疗方式。

PD-1 是一种跨膜蛋白，在B 细胞和T 细胞中均表达。其受体程序性死亡蛋白配体1（PD-L1）/PD-L2是B7 家族的成员，与抗原呈递细胞（如DC 和癌细胞）有关。当其与PD-L1 和PD-L2 相互作用后，会触发一系列下游信号并抑制T 细胞活化。由于CD8+T细胞在消除癌细胞中起着重要的作用，因此T 细胞活化被抑制后会干扰癌症的根除并使其免疫逃逸。研究表明HPV 感染会影响宫颈癌中PD-L1 的表达，并发现HPV 阳性与PD-L1 的表达呈正相关，同时高危HPV 的E6/E7 癌蛋白可以上调PD-1/PD-L1轴，针对PD-1/PD-L1 途径的检查点封锁可抑制癌症进展，改善包括转移性宫颈癌在内的几种人类癌症的存活率[5]。

CTLA-4 是一种T 细胞表面受体，与PD-1 同属于CD28 家族的T 细胞受体，其与抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80 和CD86 结合后，为T 细胞提供第二活化信号[6]。其也可通过与蛋白磷酸酶2A（PP2A）及蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2 相互作用后干扰T 细胞受体（TCR）信号，同时与磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）结合，导致蛋白激酶B（AKT）磷酸化，引起抗凋亡因子B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）基因上调，以及凋亡调节蛋白Bcl-2 相关死亡因子（BAD）失活，进而抑制机体自身抗肿瘤免疫反应，从而促进肿瘤的免疫逃逸。2011年美国食品药品监督管理局（FDA）批准的第一种针对CTLA-4 的单克隆抗体伊匹单抗显著延长了许多晚期黑色素瘤患者的无进展生存期（PFS）或总体生存期（OS）。当前Ⅰ期临床试验（NCT 01711515）也正在观察伊匹单抗辅助进展期宫颈癌放化疗的疗效[7]。

2.2 治疗性HPV 疫苗对于与HPV 相关的病变和癌症，尽管可以使用预防性HPV 疫苗，但这些疫苗不会对已建立的HPV 感染和损伤产生效应。与预防性疫苗不同，治疗性疫苗旨在产生细胞介导的免疫力，而不是中和抗体。癌蛋白E6 和E7 是启动和维持HPV 相关恶性肿瘤所必需的，它们不可能通过突变逃避免疫反应，由于这些原因，E6 和E7 是治疗性HPV 疫苗的理想靶标[8]。目前国内外已经开展的治疗性HPV 疫苗主要有活载体疫苗、肽和蛋白质疫苗、核酸疫苗（DNA 疫苗、RNA 疫苗）和基于细胞的疫苗。

2.2.1 基于活载体的疫苗 基于活载体的疫苗分为细菌载体疫苗和病毒载体疫苗。

2.2.1.1 细菌载体 单核细胞增生李斯特菌（Lm）是引起最多关注的细菌载体。疫苗Lm-LLO-E7（一种基于李斯特菌载体的治疗性HPV 疫苗）通过表达HPV 16 E7 抗原产生针对E7 癌蛋白的免疫应答[9]。2009年在15 例转移性、顽固性或复发性晚期宫颈鳞癌患者中进行的一项Ⅰ期临床试验已经测试了其安全性，其中4 例患者观察到肿瘤体积的减小，3 例患者的E7 特异性T 细胞反应增强，同时涉及宫颈癌（NCT01266460）的Ⅱ期临床试验正在进行中[10]。另外一项Ⅲ期临床试验正在研究ADXS11-001（一种含有Lm 基因的疫苗）作为放化疗后局部晚期宫颈癌患者的辅助免疫治疗方法（NCT02853604）[11]。

2.2.1.2 病毒载体 由于病毒天然的特性就是将自身的遗传信息转导到宿主细胞中进行复制，因此病毒是开发治疗性疫苗的良好工具。现有的病毒载体包括腺病毒及其相关病毒、甲病毒、慢病毒和痘病毒。

溶瘤腺病毒可在癌细胞中选择性复制并裂解癌细胞，其在α/β 干扰素（IFN-α/IFN-β）的作用使免疫环境中的肿瘤抗原暴露，从而将免疫抑制性的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）转化为肿瘤免疫应答的TME，进而刺激宿主对癌细胞的免疫反应。其临床前研究已经显示出强大的抗肿瘤功效，同时目前溶瘤腺病毒治疗HPV 相关疾病的临床试验也正在进行中[12]。

痘苗病毒是一种含有包膜的双链DNA 病毒，属于痘病毒（Poxvirus）家族，因其较大的高度传染性基因组，且外源DNA 不受调控地整合到其基因组中的可能性很小，其已被广泛用作免疫原。在晚期宫颈癌患者中，用TA-HPV（一种表达HPV 16 和HPV 18 E6 和E7 基因的重组痘苗病毒）进行单次治疗显示3 例患者中有1 例产生了HPV 特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）应答，8 例患者中有3 例产生了HPV 特异性抗体应答[13]。

2.2.2 基于肽和蛋白质的疫苗

2.2.2.1 基于肽的疫苗 基于肽的疫苗稳定，安全且易于生产；
但它们通常是主要组织相容性复合体（MHC）特异性的，需要匹配患者的人类白细胞抗原（HLA）类型才能有效呈现，因此该类疫苗需要佐剂来提高免疫应答。包含E6/E7 肽合成的长重叠肽（SLP）方案已经在一些临床前模型被证明是有效的，可增高机体先天性免疫和适应性免疫的能力，对20例晚期或复发性宫颈癌患者接种由E6 和E7 重叠肽以及51 油佐剂（Montanide ISA-51）组成的HPV 16 合成长肽疫苗（HPV 16-SLP）后，9 例出现了HPV 16 特异性T 细胞应答[14]。此外，由HPV 16 的E6 和E7 基因片段组成的长肽疫苗（ISA101/ISA101b）正在进行Ⅱ期临床试验，旨在评估其与紫杉醇和卡铂（加或不加贝伐单抗）联合治疗晚期或复发性宫颈癌的安全性及有效性。

2.2.2.2 基于蛋白质的疫苗 在早期的治疗性疫苗中已经使用过E6/E7 或HPV 融合蛋白作为抗原来源，这些疫苗的优势在于包括许多CD4+和CD8+T 表位，因此不受MHC 的限制，然而蛋白质疫苗的潜在缺点是它们可能诱导抗体应答而不是CTL 应答，抗原靶向DC 的融合蛋白以及使用佐剂可以增强免疫原性。TA-CIN 是一种由HPV 16 L2、E6 和E7 组成的融合蛋白亚单位疫苗，其在治疗外阴上皮内瘤变2/3（VIN2/3）的Ⅱ期试验中，有63%接种TA-CIN 疫苗1年后的患者CD4+和CD8+T 细胞增加，而VIN完全消退[15]。目前，TA-CIN 疫苗正在用于HPV16 相关的宫颈癌患者，并进行评估以确定其安全性和可行性及其对HPV 抗原特异性免疫应答的诱导。

2.2.3 核酸疫苗

式中,φi(i=1,2,…,p)为模型的待定系数,p为自回归模型的阶数,ak为误差,xk为一个平稳时间序列。该文分析对比了AR(1),AR(2),AR(3),AR(4)4种误差模型,依据AIC函数准则确定模型阶数。AIC准则函数为:

2.2.3.1 基于DNA 的疫苗 DNA 疫苗大都是细菌衍生的质粒在启动子的控制下经过基因工程改造以编码免疫原，从而促进DNA 在细胞中稳定表达并诱导适应性免疫。尽管DNA 疫苗具有如稳定、易于生产和可重复给药等优点，但其缺乏相对的免疫原性，通过电穿孔、包封、基因枪或激光疗法等递送疫苗已确定是可增强免疫原性的方法。而目前DC 是DNA疫苗开发的关键要素，因为DC 是能够引发幼稚T细胞的重要抗原呈递细胞。

Kim 等[16]开发的DNA 疫苗GX-188E 通过表达Fms 样酪氨酸激酶3 配体（FLT3L）可以激活DC，其中9 例HPV 16/18 阳性的CIN3 患者中有8 例会引起E6/E7 特异性分泌IFN-γ 的T 细胞反应，其中7 例患者在随访36 周内显示出病变完全消退。VGX-3100是由针对HPV 16/18 E6 和E7 蛋白的2 个DNA 质粒组成的疫苗，在对18 例CIN2/3 患者的临床试验中，有14 例表现出诱导的HPV 特异性CD8+T 细胞具有完全的细胞溶解功能，17 例患者的HPV 16 E7抗体滴度升高，所有患者的HPV 18 E7 抗体滴度均升高；
此外，有12 例的HPV 16 E6 抗体滴度增加，7例患者的HPV 18 E6 滴度增加。换言之，已证实VGX-3100 是对HPV 16、18 感染的宫颈癌前病变有效的DNA 疫苗[17]。

2.2.3.2 基于RNA 的疫苗 基于RNA 的疫苗源自正负单链RNA 病毒的RNA 复制子系统。RNA 复制子是裸露的RNA，可以自我限制的方式在转染细胞内复制。RNA 复制子疫苗的明显优势是其能够在多种细胞中自我复制，可帮助维持细胞抗原表达，从而使它们能够比常规DNA 疫苗产生更多的目标蛋白质，然而其局限性是稳定性差且不易在细胞间扩散。克服这一缺陷是将RNA 复制子和DNA 疫苗组合成DNA 发射的RNA 复制子，也称为“自杀性DNA”。研究发现通过在“自杀性DNA”中加入编码抗凋亡蛋白的基因或者使用黄病毒Kunjin（KUN）载体递送复制子增强其免疫原性[18]。V vax001 是一种来自森林脑炎病毒的RNA 复制子，其编码HPV 16 E6 和E7 融合蛋白，目前正在进行一项临床研究以评估其对晚期宫颈癌患者的有效性和安全性（NCT03141463）[19]。

2.3 基于细胞的免疫疗法

2.3.1 基于DC 的疫苗 基于DC 的HPV 疫苗已成为对抗HPV 相关恶性肿瘤的潜在治疗疫苗，因为它们不仅是主要的抗原呈递细胞，也可以作为天然佐剂增强针对癌症的抗原特异性免疫疗法的效力。目前尽管可以通过用针对促凋亡分子的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染DC，但仍有因为技术要求导致无法大规模生产、有效的疫苗给药途径尚不确定、需要患者提供足够的自体DC、转导效率低、终末分化DC 无法体外扩增以及DC 寿命有限等局限[20]。基于DC 的疫苗可以分为用HPV 特异性肽/蛋白质抗原脉冲化的DC 或用编码外来抗原的DNA/病毒载体转导的DC，同样因为未成熟的DC 缺乏完整的T 细胞共刺激活性，导致大多数试验必须使用成熟的DC。

有学者先后将DC 疫苗用于治疗早期宫颈癌和复发、难治性宫颈癌患者，结果均提示无临床获益，仅部分患者有血清学效应[21]。但Aipire 等[22]发现甘草水提取物（GUWE）可以促进DC 的成熟并增加了机体内细胞因子的产生，同时证明GUWE 诱导了HPV特异性细胞应答并抑制了荷瘤小鼠的肿瘤生长，这在某种程度上为DC 疫苗的开发提供了一种策略。

2.3.2.1 TILs 治疗 TILs 是一组异质淋巴细胞，它们浸润原发性肿瘤、转移组织和带有肿瘤的淋巴结，从而控制肿瘤生长。相较于外周淋巴细胞，肿瘤浸润淋巴细胞中有较高比例的肿瘤特异性T 细胞。已证明白细胞介素7（IL-7）和IL-15 相较于IL-2 可以使离体的肿瘤反应性TIL 扩增最大化。有研究发现输注的TIL（主要为CD8+）能够转运、浸润和破坏肿瘤细胞，导致大多数患者的癌症消退并产生具有肿瘤抗原特异性的记忆T 细胞，并可在患者体内循环进而对癌症发挥持续作用，从而证实了ACT 疗法在晚期宫颈癌患者治疗中的可行性[23]。

2.3.2.2 TCR-T 治疗 大多数控制细胞生长、增殖和死亡的肿瘤特异性抗原位于细胞内。针对这些抗原已经开发出一组被称为TCR 样抗体的特殊抗体用于临床治疗。细胞内肿瘤特异性抗原可通过MHCⅠ类信号通路，以肿瘤特异性多肽/MHC 复合物的形式存在于肿瘤细胞表面。表达在T 细胞表面的TCR对多肽/MHC 复合物的识别可以触发多种效应，如T细胞的增殖和分化以及细胞因子或趋化因子的分泌。然而，与T 细胞中的TCR 相比，TCR 样抗体可以触发抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、补体依赖性细胞毒性（CDC）、抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）或直接诱导细胞凋亡。Jin 等[24]进行了一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验（NCT02858310），以确定E7 TCR 改造的T 细胞在HPV 16 相关癌症中的安全性和有效性，其不但表现出效应T 细胞功能，亦可增强人体对宫颈癌的抗肿瘤活性，目前该研究仍在进行中。

2.3.2.3 CAR-T 治疗 CAR 是一种合成的细胞表面受体，由细胞外靶向元件组成，可介导对肿瘤表达的表面蛋白的识别和T 细胞功能的信号域。CAR-T细胞的抗原识别域通常来自与单链可变片段（scFv）连接在一起的单克隆抗体（MAb）的可变区，可以识别肿瘤相关抗原（TAA）。

针对CD19 的嵌合抗原受体T 细胞（CART19）在血液系统肿瘤中的应用已显示出巨大的成功，治疗后超过90%的患者观察到完全缓解，这为CAR-T疗法在实体瘤中的应用奠定了基础[25]。目前CAR-T在HPV 感染及宫颈癌方面的研究仍处于探索阶段，更重要的是，缺乏合适的靶标也限制了CAR-T 在临床上用于包括宫颈癌在内的实体瘤的治疗。

2.4 免疫治疗的未来随着免疫疗法在癌症中的发展，其在许多恶性肿瘤中显示出强大的临床疗效，包括在许多癌症患者中延长患者的PFS 或OS，同时针对免疫检查点蛋白的单克隆抗体已取得了成功。但是大多数患者最初对治疗无反应或者是单一免疫疗法疗效有限，因此需要通过结合相关传统治疗或者开发具有协同作用机制的药物进一步增强单一免疫疗法的临床治疗益处，从而使免疫疗法作为常见恶性肿瘤治疗的选择变得更加广泛。免疫疗法与化学疗法的结合在三阴性乳腺癌和HPV 阳性的头颈部鳞状细胞癌患者中相较于以往的治疗有较高的反应率，免疫治疗联合放射疗法在晚期肺癌治疗中以及纳米药物在增强免疫治疗方面的研究也取得了重要进展[26]。目前正在研究免疫治疗剂协同组合以及免疫疗法与靶向治疗的新型三联方案，这些方法都将提升免疫疗法临床成功的潜力。

尽管癌症免疫疗法已成功应用于多种人类癌症，但相关循证医学证据表明只有少数晚期肿瘤患者在这些疗法中实现了持久的生存，癌症在不同患者体内呈现的方式不同，特定人种的肿瘤也可能不同。这些都表明人体免疫系统与癌症之间相互作用的复杂性和可调节性，意味着癌症免疫疗法目前依然面临着诸多挑战[27]。目前正在进行以开发用于免疫疗法的新型递送平台的研究，改进的技术可以增加癌组织内免疫效果的积累，也可以克服CAR-T 细胞和TCR-T 细胞相关的毒性，还能够更有效地靶向所需的肿瘤或者减少脱靶的不良反应。有研究表明基于DC 的疫苗和核酸疫苗会极大受益于改进的递送技术，但该领域的递送技术设计目前仍处于起步阶段[28]。

免疫治疗的目标虽说是激活针对肿瘤细胞的免疫系统，但是不可避免地要考虑到肿瘤诱导的免疫抑制性微环境。在大多数患者中，无论是通过检查点封锁还是基于T 细胞疗法，都会受到免疫抑制性微环境的限制。肿瘤微环境中的免疫抑制细胞[髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞或者调节性T 细胞（Treg）]的增加都促进了肿瘤逃避免疫监视，限制了抗肿瘤免疫反应。未来通过进一步了解肿瘤免疫抑制的机制，以及阐明免疫抑制细胞与效应T 细胞相互作用的机制，这对于了解肿瘤微环境中的免疫调节网络至关重要，也会为开发癌症免疫治疗提供进一步的基础[29]。

癌症免疫疗法成为多种类型癌症的新治疗选择，为复发性癌症患者带来了新的希望。癌症免疫疗法的目标是有针对性地激活宿主免疫系统，以增强对恶性细胞的识别和根除。从最初的目标识别和验证到临床前研究，到早期的“概念验证”临床试验、后期疗效、安全性和经济评估再到最终批准，都需要克服巨大的障碍，因此挑战是艰巨的。与此同时在宫颈癌层面仍然缺少更多的数据支持，当前在宫颈癌层面有多个正在进行的临床试验，初步结果显示临床缓解率并不是很高。宫颈癌是由HPV 驱动的，HPV通过各种机制逃避了宿主的免疫反应，所以未来也有必要使用良好的生物标志物来确定获得最大益处的患者，也需要更多的前瞻性研究来确定免疫疗法、放射疗法和化学疗法的最佳组合。