piR-16744对缺氧—复氧诱导的小鼠原代心肌细胞焦亡作用及机制研究

王 飞，陈鑫哲，王 凯，单 婵

(青岛大学转化医学研究院，青岛 266021)

近年，中国心梗患者数量持续上升[1]。当前有效治疗心梗的方法是恢复缺血心肌血供[2]。大量临床证据和实验证实，缺血心肌的血运重建时可能诱发缺血/再灌注(ischemic/reperfusion, I/R)损伤，影响了再灌注治疗的疗效[3]。I/R所引发的心肌损伤伴随着炎症的发生，而细胞在焦亡过程中亦会释放大量炎症因子[4-5]。细胞焦亡具有典型的生物学特征，如细胞肿胀，明显的泡状突出物，消皮素D(Gasdermin D, GSDMD)在质膜上穿孔，细胞膜破碎等，并释放白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18)等炎症因子[6-7]。细胞焦亡的两条主要信号调控通路分别是依赖Caspase-1的经典通路和依赖Caspase-4/5(人)、Caspase-11(鼠)的非经典通路[8-9]。小鼠生殖细胞中发现一种长度约为30 nt的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)，需要与PIWI(P-element Induced Wimpy Testis)蛋白家族成员相结合才能发挥调控作用[10]，被命名为Piwi-interacting RNA(piRNA)。后续piRNA相关研究逐渐揭示了其在调节心肌细胞肥大[11]、坏死[12]等方面的重要作用。但目前piRNA在心肌细胞焦亡过程中的作用尚不明确。本研究通过体外构建缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation, H/R)小鼠原代心肌细胞(Primary neonatal mouse cardiomyocytes, NMCs)焦亡模型，探讨piR-16744在NMCs焦亡过程中的作用及分子机制，为缓解和逆转心肌损伤提供理论依据。

1.1 实验材料

乳鼠(青岛大任富成畜牧有限公司)；
青霉素与链霉素、DMEM/F12培养基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)(Dalian Meilun Biotechnology Co., LTD)；
胶原酶(Worthington Biochemical Co., Ltd)；
胰液素(Sigma Reagents Co., Ltd)；
逆转录试剂盒、SYBR Green核酸荧光染料试剂盒(Accurate Biology)；
转染试剂(TransGen Biotech)；
干扰RNA(small interfering, siRNA)(GenePharma)；
LDH Cytotoxicity Assay Kit(LDH)(Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute)；
蛋白裂解液、Propidium Iodide(PI)染液(Beijing solarbio science﹠technology co.,ltd.)；
消皮素D(Gasdermin D, GSDMD)、GSDMD-C、Caspase-1、IL-1β和IL-18抗体(ZEN-BIOSCIENCE)；
内参β-Tubulin、GAPDH抗体(ABclonal)；
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)标记的二抗(Absin)。

1.2 实验方法

1.2.1 分离培养NMCs 使用75%乙醇喷洒小鼠乳鼠，无菌条件下剖取乳鼠心脏，置于磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline, PBS)(pH 7.4)中清洗血液后破碎；
加入由4%胰液素和1.4%二型胶原酶配制的裂解液，置于37℃水浴中裂解；
1 000 r/min离心5 min取上清，过100目筛网，接种于DMEM/F12培养基(含10% FBS，10 g/L的青链霉素混合液)中；
置于恒温常氧培养箱(37℃，含95%空气、5% CO2)1.5 h；
上清转移到新鲜培养基中再培养24 h[13]。

1.2.2 体外构建NMCs的H/R模型 细胞培养12 h，换为无糖无血清的DMEM/F12培养基；
置于恒温低氧培养箱(37℃，含95% N2和5% CO2)中分别缺氧处理0 h、6 h、12 h、24 h；
取出细胞，更换为正常的DMEM/F12培养基，置于恒温常氧培养箱中复氧处理6 h[14]。

1.2.3转染及分组NMCs 由吉玛基因合成过表达piR-16744的序列记为agomir-piR-16744和敲低piR-16744的序列记为antagomir-piR-16744。NMCs接种于6 cm皿中，12 h后按照转染试剂说明书的方法分别转染NC、agomir-piR-16744、antagomir-piR-16744，培养24 h至48 h。转染agomir-piR-16744的NMCs需要再进行H/R 6/6h的处理。将空白对照组记为A组，H/R组记为B组，转染NC记为C组，转染agomir-piR-16744记为D组，转染antagomir-piR-16744记为E组，共转染antagomir-piR-16744和antagomir-Caspase-1记为F组。piR-16744相关名称及序列详见表1。

表1 piR-16744相关名称及序列

1.2.4 细胞死亡率检测 去除原细胞培养基，PBS清洗3次，加入适量PI溶液(1∶1 000稀释)，37℃孵育15 min，PBS清洗3次后在荧光显微镜下观察PI阳性染色比例。取细胞培养基上清液，根据LDH试剂说明书所述方法进行溶液配制，450 nm波长下，使用酶标仪检测细胞培养基上清液中LDH的吸光度值。

1.2.5 Western blot实验 收集每组NMCs，提取细胞中的总蛋白，通过二辛可宁酸法测定每组总蛋白浓度，并调整至相同浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。湿式转膜法转膜。将PVDF膜置于TBST封闭液(含5%脱脂奶粉)中室温1.5 h。洗膜(将膜放在水平摇床上，用TBST洗3次，每次8 min)。使用含5%牛血清白蛋白的TBST稀释一抗(β-Tubulin、GAPDH，1：10 000稀释；
GSDMD、GSDMD-C、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18，1∶1 500稀释)，4℃摇床过夜孵育。次日洗膜。加入HRP标记的二抗(1∶10 000稀释)常温孵育1.5 h，洗膜。使用增强型化学发光试剂显影。

1.2.6 统计学分析 利用软件Graphpad Prism7进行统计学分析。计量资料数据以x±s表示，两独立样本比较采用t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2.1 NMCs H/R时间的筛选

设置6/6 h、12/6 h、24/6 h的缺氧/复氧时间梯度，培养NMCs并提取细胞总蛋白，WB(Western blot)实验检测各焦亡相关蛋白的表达水平见图1。可知，在6/6 h时GSDMD、GSDMD-C、Caspase-1等焦亡相关蛋白表达量较对照组明显增加，表明NMCs经缺氧6 h复氧6 h处理后发生明显焦亡。

图1 6/6 h后NMCs中焦亡相关蛋白的表达水平(a)Western blot检测各组NMCs中GSDMD和GSDMD-C的蛋白表达水平；
(b)Western blot检测各组NMCs中Caspase-1的蛋白表达水平

2.2 piR-16744的表达变化及其被抑制后的功能

piRNA在心肌祖细胞和心肌细胞中均有表达，且在心肌细胞分化和心肌损伤修复中发挥重要作用，如缺失piRNA CHAPIR可显著改善心肌肥厚并恢复心脏功能[11]。通过qPCR验证发现piR-16744在焦亡的NMCs中表达明显降低，因此选取其为研究对象，探索其在NMCs焦亡中的作用。E组转染antagomir-piR-16744后piRNA表达量相较于空白对照组A组降低。E组中GSDMD、GSDMD-C、Caspase-1、ASC、IL-1β以及IL-18相较于A组和转染NC的C组均明显增多，表明E组发生了明显焦亡。同时，检测各组NMCs的死亡率，E组NMCs的死亡率显著增加。由图2可知，在NMCs中，抑制piR-16744的表达可促进焦亡的发生。

图2 piR-16744的表达分析及抑制其表达后的功能验证(a)qPCR检测piR-16744在H/R后的表达水平，与0/0 h组比较，P<0.05；
(b)转染antagomir后piR-16744的表达水平；
(c)Western blot检测各组GSDMD和GSDMD-C的蛋白表达水平；
(d)Western blot检测各组Caspase-1的蛋白表达水平；
(e)Western blot检测各组ASC的蛋白表达水平；
(f)Western blot检测各组IL-18的蛋白表达水平；
(g)Western blot检测各组Pro-IL-1β和IL-1β的蛋白表达水平；
(h)LDH法检测细胞死亡率，与C组比较，P<0.05；
(i)PI染色检测细胞死亡率，与C组比较，P<0.05

2.3 过表达piR-16744的功能

过表达NMCs中piR-16744，研究其对NMCs焦亡的影响。WB检测焦亡相关蛋白GSDMD、GSDMD-C、Caspase-1以及ASC的表达水平，见图3。可知，与H/R组B组相比，转染agomir-piR-16744的D组焦亡相关蛋白的表达水平，炎症相关因子IL-1β、IL-18的蛋白表达水平均降低，表明D组焦亡水平下调。同时，检测各组NMCs的死亡率，发现D组NMCs死亡率相较于B组或C组显著降低，见图3。综上，过表达piR-16744可以抑制因H/R诱导的NMCs焦亡。

图3 过表达piR-16744后的功能验证(a)转染agomir后piR-16744的表达水平。与A组比较，P<0.05；
(b)Western blot检测各组GSDMD和GSDMD-C的蛋白表达水平；
(c)Western blot检测各组Caspase-1的蛋白表达水平；
(d)Western blot检测各组ASC的蛋白表达水平；
(e)Western blot检测各组IL-18的蛋白表达水平；
(f)Western blot检测各组Pro-IL-1β和IL-1β的蛋白表达水平；
(g)LDH法检测细胞死亡率，与C组比较，P<0.05；
(h)PI染色检测细胞死亡率，与C组比较，P<0.05

2.4 piR-16744发挥作用的信号通路

由图4可知，E组与A组或C组相比，其焦亡相关蛋白GSDMD、GSDMD-C以及炎症相关因子IL-1β、IL-18表达上调。但相较E组，共转染antagomir-piR-16744和antagomir-Caspase-1的F组中GSDMD、GSDMD-C、IL-1β、IL-18表达量降低。综上，在NMCs中，piR-16744通过依赖Caspase-1的焦亡经典信号通路发挥其生物学功能。

图4 piR-16744参与的信号通路验证(a)Western blot检测各组GSDMD和GSDMD-C的蛋白表达水平；
(b)Western blot检测各组IL-18、Pro-IL-1β和IL-1β的蛋白表达水平

关于依赖Caspase-1程序性细胞死亡的报道，最早是用福氏志贺氏菌处理小鼠巨噬细胞后迅速引起细胞死亡[15]。细胞死亡命名委员会于2018年定义焦亡是一种程序性的细胞死亡方式[16]。GSDMD在焦亡细胞质膜上造成孔洞，水分子进入引发细胞肿胀，致使质膜被快速破坏，细胞发生裂解，伴随大量促炎因子进入细胞外环境[17-18]，因此细胞焦亡在多种炎症相关疾病中发挥重要作用[19-20]。本研究中，H/R 6/6 h时焦亡现象最为明显，而其他时间截点无此现象，可能是诱发了细胞凋亡、铁死亡等其他程序性细胞死亡方式，但具体调节机制尚不明确。因此，深入了解细胞焦亡在疾病中发挥作用的分子机制和调控疾病的机理，有助于探究疾病产生和发展过程，开发用于疾病临床诊断和治疗的新策略。

NcRNA是一类具有广泛调控作用的功能性RNA，参与生命体和器官发育[21-23]及生理病理过程[24-25]，也可被用作心血管疾病的诊疗靶点和工具，如miR-17-92簇是目前调控心肌细胞增殖效果最为显著的MicroRNA簇之一。它对心肌细胞增殖的促进效果在胚胎期至成人期整个过程都非常明显，同时该miRNA对心肌梗死损伤后修复也具有一定的效果[26-27]；
在小鼠动脉粥样硬化模型中，抑制miR-181b表达可促进巨噬细胞TIMP-3的表达和血管平滑肌细胞弹性蛋白的产生，从而改善小鼠动脉粥样硬化[28]；
最新研究表明，H/R处理的心肌细胞和I/R损伤的小鼠心脏中，心肌坏死相关环状RNA(CNEACR) mmu-circ-000338过表达可缓解由H/R和I/R所导致的心肌细胞坏死，使心肌梗死区域显著减少，改善心功能[29]。随着ncRNA相关研究的不断深入，研究发现ncRNA的异常表达与细胞焦亡和心脑血管疾病之间具有一定的相关性[30]。

心肌肥厚期间，缺失piRNA CHAPIR可显著改善心肌肥厚并恢复心脏功能，而过表达piRNA CHAPIR则增强小鼠的病理性肥厚反应[11]。此外，在H2O2处理的H9C2心肌细胞中，抑制piR-10555表达可改善心肌细胞坏死的状况[12]。但目前piR-16744在心肌细胞焦亡过程中的作用与机制研究相对较少。因此，探究piR-16744在心血管疾病，特别是I/R损伤中的机制，有助于深入了解心血管疾病相关病理生理过程，且具有重要的临床应用价值。

本研究在体外构建H/R NMCs模型，发现NMCs在H/R 6/6h时细胞焦亡相关蛋白的表达水平显著提高，且piR-16744通过依赖Caspase-1的经典信号通路参与调控H/R诱导的NMCs焦亡。研究结果可为阐明piRNA调控心肌细胞焦亡和心脏损伤的功能研究提供一定的理论支撑。今后研究仍需探索piR-16744调控心肌细胞焦亡的具体分子机制及其在心血管疾病中的作用。