氮肥协同EDDS强化三叶鬼针草修复镉污染土壤

郑 彦，陈银萍，姚彩萍，杨衍龙，赵镇贤，王彤彤

（兰州交通大学 环境与市政工程学院，兰州 730070）

根据2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，我国土壤重金属污染中镉（Cd）的污染点位超标率达到7%.2016年5月28日，国务院颁布了《土壤污染防治行动计划》，建议重点监测五种重金属元素，其中Cd被列为首位，治理土壤Cd污染已成为我国亟待解决的问题［1］.

近年来，植物修复技术在重金属污染土壤的修复中得到了广泛应用，其不仅成本低廉、效果显著，而且不会产生二次污染，对植物修复技术在重金属污染土壤修复中的应用探究具有重要的实践意义与应用价值［2］.

三叶鬼针草（Bidens pilosa L.）是一年生草本植物，生物量大，根系发达，抗逆性强，具有较强的争光、争水和争肥能力，对重金属污染耐受性强，富集转运能力强，是修复重金属污染土壤的理想种质资源［3］.

氮肥是农业生产中使用最多的肥料，酰胺态氮肥、铵态氮肥和硝态氮肥等各种形态的氮肥在我国农业生产中广泛应用［4］.大量氮肥施用于土壤时，会影响土壤理化性质和植物生理特性，进而影响重金属迁移和生物有效性，这些影响对植物吸收Cd有重要意义.并且不同形态、不同浓度的氮肥对植物吸收累积Cd的影响是有差异的.

乙二胺二琥珀酸（EDDS）作为乙二胺四乙酸（EDTA）的结构异构体，不仅螯合能力强，能与过渡金属、放射性核素等形成稳定的螯合物，而且毒性较低，在5～8 d内可完全降解，且降解产物是无害的，对土壤微生物影响也较小［5］.

目前，对于三叶鬼针草［6-7］、螯合剂［8-11］以及氮肥［12-14］的单一研究有很多.然而，将氮肥作为一种植物修复强化措施与螯合剂EDDS共同作用以期增强三叶鬼针草对Cd污染土壤修复效果的研究还较为少见.大多数超富集植物因生长缓慢且生物量不高而限制了它们在大田中大面积的应用，所以可以通过添加氮肥来促进超富集植物的生长.而由于重金属被限制固定在土壤中，以至于植物修复的效率低，则可以通过添加EDDS活化土壤重金属来提高植物修复的效率.

本文通过室内盆栽试验，研究了15 mg·kg-1Cd（CdCl2·2.5H2O）胁迫下，硝态氮（硝酸钙）、铵态氮（硫酸铵）、酰铵态氮（尿素）三种氮肥在不同浓度（25、50、75 mg N·kg-1）下与1 mmol·L-1EDDS联合施加对三叶鬼针草幼苗修复Cd污染土壤的影响，以期为氮肥协同EDDS强化植物修复技术应用于Cd污染土壤的修复提供科学依据.

1.1 试验材料与试剂

试验所用三叶鬼针草种子购自泰山野菜种植基地.天津市大茂化学试剂厂生产的分析纯CdCl2·2.5H2O以溶液形式加入到土壤中模拟Cd污染，使土壤Cd浓度为15 mg·kg-1.EDDS为麦卡希试剂，现配现用.其它试剂均为国产分析纯.

1.2 试验设计

利用采自甘肃省兰州市榆中县周边村庄的农田耕地土壤（0～20 cm的表层土）作为原土（见表1）.土壤采集后，将供试土壤风干后过2 mm筛，每盆1.5 kg［15］，与一定量污染物（以CdCl2·2.5H2O模拟Cd胁迫，浓度为15 mg·kg-1［16-17］）充分混匀后装入塑料盆（口径18 cm，高度25 cm）.平衡3周.选取均匀、饱满的三叶鬼针草种子，将其浸泡在1% NaClO溶液中10 min，用蒸馏水冲洗干净，晾干后播种以提高种子的发芽率和抗病性［18］.将种子播种到塑料盆中，播种深度0.5 cm［19］，播种后立即将25、50、75 mg N·kg-1［20-21］三种浓度的硝态氮（硝酸钙）、铵态氮（硫酸铵）、酰胺态氮（尿素）［22］分别以溶液形式施入盆栽中，在温度15～25℃，色温6 500 K光照下，每天光照14 h（6：00-20：00），黑暗10 h［23］，将盆栽置于光照培养架上，不定期更换位置，待发芽后间苗，每盆50株［24］，以自来水浇灌，使土壤含水量保持在植物需求的正常生长水平，为防止污染物淋溶渗漏损失，在盆下放置塑料托盘并将渗漏液倒回盆中.为避免其他物质影响结果，试验中不喷施农药，不追施化肥.待三叶鬼针草幼苗生长60天后将1 mmol·L-1EDDS［25］配成100 mL溶液施入到土壤中，培养7天后进行实验测试，具体处理方案见表2.

表1 农田耕地土壤理化性质Tab.1 The physical and chemical properties of farmland soil

表2 处理方案Tab.2 Treatment plan

1.3 测定方法

待测土壤pH采用电位法［26］测定，电导率采用电极法［27］测定，过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法［28］测定，脲酶活性采用靛酚蓝比色法［28］测定.土壤Cd含量采用石墨炉原子吸收分光光度法［29］测定，Cd形态采用Tessier五步提取法［20］测定.

1.4 数据分析

运用Excel和SPSS 24进行数据处理和分析，origin2018制图.采用单因素方差分析（ANOVA）和Duncan’s多重极差检验进行显著性分析.采用双变量Pearson双尾检验进行相关性分析.

2.1 对土壤理化性质与酶活性的影响

不同形态氮肥协同EDDS处理土壤pH值均低于原土；
硝态氮处理，土壤pH值高于Cd处理；
铵态氮处理，土壤pH值低于Cd处理；
酰胺态氮处理，总体土壤pH值高于Cd处理.pH值在EDDS+75 mg N·kg-1硝态氮处理下达到最小值，较Cd处理减少了7.28‰（P＞0.05）（见图1）.

图1 氮肥协同EDDS对土壤pH值的影响Fig.1 Effect of nitrogen fertilizer combined with EDDS on soil pH

所有处理土壤电导率总体上均高于原土.各组间随着氮肥浓度的升高，电导率总体呈上升趋势，且在EDDS+75 mg N·kg-1铵态氮处理下，提升最大，较Cd处理显著增加了11.77%（P＜0.05）（见图2）.

图2 氮肥协同EDDS对土壤电导率的影响Fig.2 Effect of nitrogen fertilizer combined with EDDS on soil conductivity

所有处理土壤过氧化氢酶活性总体上均高于未添加重金属Cd的土样.随着氮肥浓度的升高，硝态氮和铵态氮处理呈先上升后下降趋势，酰胺态氮呈下降趋势.在EDDS+50 mg N·kg-1硝态氮处理条件下，土壤过氧化氢酶活性达到最大值，较Cd处理显著增加了210.34%（P＜0.05）（见图3）.

图3 氮肥协同EDDS对土壤过氧化氢酶活性的影响Fig.3 Effect of nitrogen fertilizer combined with EDDS on soil catalase activity

所有处理土壤脲酶活性均高于未添加重金属Cd的土样.随着氮肥浓度的升高，硝态氮处理呈上升趋势，铵态氮处理呈先上升后下降趋势，酰胺态氮处理呈下降趋势.在EDDS+75 mg N·kg-1硝态氮处理条件下，土壤脲酶活性达到最大值，较Cd处理显著增加了29.18%（P＜0.05）（见图4）.

图4 氮肥协同EDDS对土壤脲酶活性的影响Fig.4 Effect of nitrogen fertilizer combined with EDDS on soil urease activity

所有处理土壤全氮量总体上均高于原土.随着氮肥浓度的升高，硝态氮处理呈上升趋势，铵态氮处理呈先上升后下降趋势，酰胺态氮处理呈下降趋势.在EDDS+25 mg N·kg-1酰胺态氮处理条件下，土壤全氮量达到最大值，较Cd处理显著增加了6.04%（P＜0.05）（见图5）.

图5 氮肥协同EDDS对土壤全氮量的影响Fig.5 Effect of nitrogen fertilizer combined with EDDS on soil total nitrogen

2.2 对土壤Cd含量和形态的影响

土壤中Cd含量随着氮肥浓度的升高，经硝态氮处理呈下降趋势，铵态氮处理呈先下降后上升趋势，酰胺态氮处理呈先上升后下降趋势.在EDDS+50 mg N·kg-1硝态氮处理条件下，土壤Cd含量达到最小值，较Cd处理显著减少了5.97%（P＜0.05）（见图6）.

图6 氮肥协同EDDS对土壤Cd含量的影响Fig.6 Effect of nitrogen fertilizer combined with EDDS on soil Cd content

土壤Cd的去除率在EDDS+50 mg N·kg-1硝态氮处理条件下达到最大值，达到了12.44%，较Cd处理显著增加了80.65%（P＜0.05）（见图7）.

图7 氮肥协同EDDS对Cd去除率的影响Fig.7 Effect of nitrogen fertilizer combined with EDDS on Cd removal rate

Cd污染土壤中Cd主要以碳酸盐结合态（F2）、铁锰氧化物结合态（F3）的形式存在，其中碳酸盐结合态（F2）占比最大，约占总量的31% ～41%，其次为铁锰氧化物结合态（F3），约占总量的22% ～32%，之后依次为有机结合态（F4）、可交换态（F1）、残渣态（F5），含量占比分别为12% ～20%、9% ～14%和6% ～10%.经EDDS单独处理后，F1、F2、F4、F5形态含量下降，分别较Cd处理显著减少了11.89%、3.30%、6.78%、18.36%（P＜0.05）；
F3形态含量上升，较Cd处理显著增加了20.91%（P＜0.05）.经不同浓度氮肥与EDDS联合处理后，随着氮肥浓度升高，F2形态含量占比呈上升趋势，F4、F5形态含量占比呈下降趋势.F1形态含量占比在EDDS+75 mg N·kg-1硝态氮处理条件下达到最大值，达到了14.17%，较Cd处理显著增加了11.10%（P＜0.05）；
F2形态含量占比在EDDS+75 mg N·kg-1酰胺态氮处理条件下达到最大值，达到了41.11%，较Cd处理显著增加了10.86%（P＜0.05）；
F3形态含量占比在EDDS+75 mg N·kg-1硝态氮处理条件下达到最小值，达到了21.80%，较Cd处理显著减少了17.49%（P＜0.05）；
F4形态含量占比在EDDS+75 mg N·kg-1酰胺态氮处理条件下达到最小值，达到了12.47%，较Cd处理显著减少了8.24%（P＜0.05）；
F5形态含量占比在EDDS+75 mg N·kg-1铵态氮处理条件下达到最小值，达到了6.21%，较Cd处理显著减少了38.80%（P＜0.05）.（见图8）.

图8 氮肥协同EDDS对土壤Cd形态变化的影响Fig.8 Effect of nitrogen fertilizer combined with EDDS on soil Cd form changes

2.3 氮肥与土壤理化性质及Cd含量的相关性分析

硝态氮处理土壤Cd含量与土壤pH值呈显著负相关（P＜0.05），与土壤脲酶活性呈显著正相关（P＜0.05），与土壤全氮呈极显著正相关（P＜0.01）；
土壤pH值与土壤全氮呈极显著负相关（P＜0.01），与硝态氮呈显著负相关（P＜0.05）；
土壤过氧化氢酶活性与土壤脲酶活性呈显著正相关（P＜0.05）；
土壤脲酶活性与硝态氮呈极显著正相关（P＜0.01）；
土壤全氮与硝态氮呈显著正相关（P＜0.05）（见表3）.铵态氮处理土壤Cd含量与土壤pH值呈极显著负相关（P＜0.01），与土壤全氮呈显著正相关（P＜0.05）；
土壤pH值与土壤全氮呈显著负相关（P＜0.05）；
土壤过氧化氢酶活性与土壤脲酶活性呈极显著正相关（P＜0.01），与土壤全氮呈显著正相关（P＜0.05）（见表4）.酰胺态氮处理土壤Cd含量与土壤脲酶活性呈显著正相关（P＜0.05），与土壤全氮呈极显著正相关（P＜0.01）；
土壤电导率与土壤过氧化氢酶活性呈显著负相关（P＜0.05），与土壤脲酶活性呈显著负相关（P＜0.05）；
土壤过氧化氢酶活性与土壤脲酶活性呈极显著正相关（P＜0.01），与土壤全氮呈显著正相关（P＜0.05）；
土壤脲酶活性与土壤全氮呈显著正相关（P＜0.05）；
土壤全氮与酰胺态氮呈显著正相关（P＜0.05）（见表5）.

表3 土壤理化性质及Cd含量与硝态氮的相关性分析Tab.3 Correlation analysis of soil physical and chemical properties and Cd content with nitrate nitrogen

表4 土壤理化性质及Cd含量与铵态氮的相关性分析Tab.4 Correlation analysis of soil physical and chemical properties and Cd content with ammonium nitrogen

表5 土壤理化性质及Cd含量与酰胺态氮的相关性分析Tab.5 Correlation analysis of soil physical and chemical properties and Cd content with amide nitrogen

3.1 氮肥协同EDDS对土壤理化性质与酶活性的影响

与本次所采集并处理后的原土相比，Cd胁迫下土壤pH下降，土壤电导率上升，土壤全氮量显著上升，表明15 mg·kg-1Cd胁迫改变了土壤理化性质.试验中的pH值变化情况与李宜联、郭春铭的研究结果不同［31-32］，pH值总体下降幅度不大，这可能是由于供试土壤基质中有机质含量较高弱化了EDDS的土壤酸化能力.当施入EDDS时，其本身的电离作用将释放部分H+而使得土壤pH值有下降的趋势.在EDDS+75 mg N·kg-1硝态氮处理下达到最小值，可能是硝态氮与EDDS促进了三叶鬼针草根系分泌有机酸等物质，有可能是影响了根系微生物群落代谢过程，从而使土壤pH下降.土壤电导率上升表明土壤中离子浓度增加，各处理能有效促进土壤Cd的活化，从而促进植物吸收，这与杜波对于EDTA强化金盏菊修复Cd污染土壤的研究结果较相似［33］，而氮肥协同EDDS进一步促进土壤电导率的提升，并且由于土壤电导率与氮肥呈正相关，所以可以推测这可能是因为氮肥促进了植物生物量的增大，改变土层结构，土壤中重金属流动性增强，促进土壤Cd的生物有效性.在EDDS+75 mg N·kg-1铵态氮处理下提升显著，一方面可能是因为EDDS对重金属离子的活化，另一方面随着植物生长能力的增强，增强了对土壤结构的扰动，使物质转换流动增加.土壤全氮量在EDDS+25 mg N·kg-1酰铵态氮处理条件下显著提升，这可能是由于尿素施入土壤后水解转化为NH+4和CO2，增强了土壤氮素的肥力.

单独施加EDDS，土壤过氧化氢酶和脲酶活性处 在较高水平，说明EDDS对土壤过氧化氢酶活性、土壤脲酶活性起显著促进作用，这与宋清玉、石福贵的研究结果相符［34-35］.各处理均能增强土壤酶活性，经硝态氮协同EDDS强化三叶鬼针草修复后的土壤过氧化氢酶和脲酶活性较原土得到显著提升.过氧化氢酶活性在EDDS+50 mg N·kg-1硝态氮处理下达到最大值，脲酶活性在EDDS+75 mg N·kg-1硝态氮处理下达到最大值.这可能是因为一方面施加EDDS对酶产生了刺激作用，另一方面由于施加氮肥促进植物的生长，对土壤产生影响，从而促进了酶活性的提升.相关性分析表明土壤过氧化氢酶活性与土壤脲酶活性呈极显著正相关，与土壤全氮呈显著正相关，与土壤电导率呈负相关，与氮肥呈正相关；
土壤脲酶活性与土壤Cd含量呈显著正相关，与土壤过氧化氢酶活性呈极显著正相关，与土壤电导率呈负相关，与氮肥呈正相关.表明可以通过增加氮肥浓度来增加土壤全氮量，提高土壤肥力，进而促进土壤过氧化氢酶活性的增强，改善土壤结构与质量.而土壤脲酶活性与土壤电导率呈负相关，与土壤Cd含量呈显著正相关，表明随着酶活性的进一步增强，分解土壤中的氮肥，造成植物缺氮烧苗，不利于植物的生长，土壤离子浓度下降，不利于植物对土壤Cd的吸附，应选择适宜浓度的氮肥来提高三叶鬼针草的修复效率.

3.2 氮肥协同EDDS对土壤Cd含量和形态的影响

单施EDDS，土壤中Cd含量显著下降，说明EDDS的施加可以活化重金属离子，增强生物有效性，增加重金属离子被植物吸收效率以降低土壤Cd含量.其中，与其他处理相比，施加硝态氮肥处理下土壤Cd含量最低，处理效果最好，这与李梦然［36］对氮肥促进植物对Cd的吸收富集研究相符，这可能是由于硝态氮可通过根系吸收和木质部的装载，最终在叶片中对植物产生刺激作用，从而促进植物对Cd的积累.硝态氮与EDDS协同作用显著降低土壤Cd含量，其中EDDS+50 mg N·kg-1硝态氮处理时，土壤Cd含量最低，Cd去除率达到12.44%，去除效果最好.表明硝态氮肥协同EDDS去除土壤中Cd含量的效果比单独施加更有效.

本次实验中Cd主要以碳酸盐结合态（F2）、铁锰氧化物结合态（F3）的形式存在，其中碳酸盐结合态（F2）占比最大，其次为铁锰氧化物结合态（F3），之后依次为有机结合态（F4）、可交换态（F1）、残渣态（F5）.经EDDS单独处理后，F1、F2、F4、F5形态含量下降，F3形态含量上升.说明EDDS的添加有利于土壤中重金属的形态转化，从而有利于植物的吸收，这与郑明霞的研究结果相似［37］.在氮肥与EDDS联合作用下，土壤重金属形态变化较明显，总体趋势为不同形态重金属向F1、F2转化，这与贾文珍对于螯合剂诱导油菜修复技术对Zn形态分布的研究结果相似，氮肥协同EDDS进一步促进土壤重金属形态的转化［38］，在EDDS+75 mg N·kg-1硝态氮处理下，F1、F2占比最大，活化土壤中Cd离子，增强生物可利用性，使Cd更易被三叶鬼针草吸收从而增强植物修复效果.

1）氮肥与EDDS联合作用修复Cd污染土壤，土壤pH下降，土壤电导率上升，土壤全氮量显著上升，土壤过氧化氢酶和脲酶活性较原土得到显著提升.

2）经EDDS处理后，土壤Cd含量下降.在EDDS+50 mg N·kg-1硝态氮处理时，土壤Cd含量最低，Cd去除率达到12.44%，去除效果最好.

3）经EDDS单独处理后，F1、F2、F4、F5形态含量下降，F3形态含量上升.在EDDS+75 mg N·kg-1硝态氮处理时，F1、F2占比最大.

综上所述，氮肥与EDDS联合作用能有效改善土壤理化性质，增强土壤酶活性，增加土壤有效态Cd含量.在EDDS+50 mg N·kg-1硝态氮处理时，对土壤Cd污染修复效果最好.