箭叶淫羊藿多糖新组分EP80的结构表征及其对酒精代谢相关酶活力的影响研究

张梦园，杨晓华，段梦月,4，张华峰,3*

1陕西师范大学食品工程与营养科学学院 中俄食品与健康科学国际联合研究中心西北濒危药材资源开发国家工程实验室，西安 710119；
2西安交通大学医学部，西安 710061；
3云南省普洱市院士专家工作站，普洱 665600；
4安徽粮食工程职业学院，合肥 230012

中药淫羊藿(Epimedii Folium)是小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epimedium)药用植物的干燥叶[1,2]，含有多糖、黄酮类化合物、生物碱等活性成分[3,4]，与肝脏健康密切相关[5,6]。据清代刘善述《草木便方》记载，淫羊藿“辛味甘温”，可用于“补肝肾”。汪昂《本草备要》认为淫羊藿“辛香甘温，入肝肾”，“补命门”。黄宫绣《本草求真》也认为淫羊藿“专入命门，兼入肝肾”。中国医学科学院陕西分院中医研究所[7]主编的《陕西中药志》指出，淫羊藿“入肝、肾二经”，可以“补肝肾”。在临床上，淫羊藿已被添加到“益肝解毒胶囊”等中成药或院内制剂中，用于消除肝损伤病征[5]。近年来，酒精过度消耗(饮酒过量)对人体健康的影响特别是酒精性肝损伤日益得到全世界的关注[8]。酒精进入人体后在肝脏中分解代谢，先由乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ALD)氧化成乙醛，再由乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ACD)氧化成乙酸，最终分解成二氧化碳和水[9]。如果酒精摄入过量或者酒精代谢相关酶活力较低，可能出现乙醛积累现象，干扰线粒体呼吸作用，生成蛋白质加合物(protein adducts)，引起肝毒性[9]。从药用植物中筛选具有解酒保肝作用的活性成分，解析其化学结构，成为中药化学领域的重要研究课题。

植物多糖可能具有调节免疫、保肝、抗氧化等功能[10]。Deng等[11]采用酶提取法从桑葚(Fructus Mori)中分离制得了具有乙醇脱氢酶激活作用和自由基清除活性的粗多糖。Zhang等[12]采用乙醇分级分离(grading-alcohol precipitation)技术从方竹(Chimonobambusaquadrangularis)中分离制得了3种多糖组分：CPS70、CPS75和CPS80，其中CPS75具有较高的体外抗氧化作用和金属螯合活性。Pan等[13]采用超声波提取法制得了朝鲜淫羊藿(Epimediumkoreanum)总多糖，并利用小鼠模型考察了其对酒精性肝损伤的预防效果。本实验室发现，心叶淫羊藿(Epimediumbrevicornu)总多糖能够清除自由基，防止DNA氧化损伤[10]。乙醇分级分离技术能够利用不同浓度的乙醇溶液将总多糖分成不同分子大小的多糖组分，从而获得均一度更高、活性更强、性质更优的新组分[12,14]。然而，迄今未见采用乙醇分级分离技术从淫羊藿多糖中筛选具有酒精代谢相关酶(乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶)激活作用的新组分的研究报道。本研究以箭叶淫羊藿(Epimediumsagittatum)为植物材料，采用乙醇分级分离技术从淫羊藿中分离得到了多糖新组分EP80，运用傅里叶变换红外光谱、圆二色谱、刚果红实验、扫描电子显微镜等方法表征了其化学结构，并研究了其抗氧化活性及对乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的效应，以期为淫羊藿资源的科学开发和综合利用提供参考。

1.1 材料、试剂与仪器

材料与试剂：淫羊藿于2020年7月15日采自秦岭南麓，经西安交通大学杨晓华博士鉴定为箭叶淫羊藿(Epimediumsagittatum)；
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，批号：101408373，纯度≥98%，美国Sigma公司)、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，批号：C11838739，纯度≥98%，上海麦克林生化科技有限公司)；
乙醇脱氢酶(批号：S10195，上海源叶公司)；
乙醛脱氢酶活性检测试剂盒(批号：BC0750，北京索莱宝公司)；
薄层层析硅胶板(批号：1.05559.0001，西安晶博公司)；
半乳糖(Gal，批号：190090-201501，纯度≥98%)、阿拉伯糖(Ara，批号：111506-200202，纯度≥98%)、木糖(Xyl，批号：111508-201605，纯度≥98%)、鼠李糖(Rha，批号：111683-201502，纯度≥98%)、葡萄糖(Glu，批号：110833-201707，纯度≥98%)标准品，以及碘化钾、正丁醇等均为国产分析纯试剂。

仪器设备：Chirascan型圆二色光谱仪(英国Applied Photophysics公司)；
Q1000DSC+LNCS+FACS Q600SDT型热分析系统(美国TA公司)；
S-3400N型扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)；
Multiskan Sky型全波长酶标仪(美国Thermo Electron公司)；
DV3TLVTJ0型粘度计(美国Brookfieldd公司)；
S1801544型紫外可见分光光度计(上海仪迈公司)；
Tensor 27型红外光谱仪(德国Bruker公司)；
FDU-1200型冷冻干燥机(日本EYELA公司)；
5804R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；
SPD-16型高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 糖组分制备方法

1.2.1.1 提取纯化

参考Yang等[10]的水提醇沉方法，将淫羊藿叶干燥、粉碎、过筛，所得淫羊藿粉与蒸馏水按照1∶20(g/mL)固液比混匀后煮沸20 min，过滤后取上清液。将上清液减压浓缩至原体积的1/3，收集浓缩液，加入4倍体积的无水乙醇，静置12 h，离心后收集沉淀并回收乙醇。除去沉淀中的蛋白质并进行纯化精制，Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析的多糖溶液上样浓度为5 mg/mL，收集单一洗脱峰流出液，使用冷冻干燥机将其冷冻干燥后制得淫羊藿总多糖[10,15,16]。

1.2.1.2 乙醇分级分离

参考Long等[14]的方法，将淫羊藿总多糖EP溶于蒸馏水中，加入无水乙醇至乙醇终浓度为40%(V/V)，搅拌后静置12 h，离心得到沉淀Ⅰ和上清液Ⅰ，沉淀Ⅰ冻干后得到多糖组分EP40。以此类推，制得多糖组分EP60和EP80(见图1)。

图1 EP80的乙醇分级分离Fig.1 Grading-alcohol precipitation of EP80

1.2.2 多糖定性、定量方法

1.2.2.1 Molish实验

参考Ye等[17]的方法，取淫羊藿多糖组分EP80溶液，加入α-萘酚乙醇溶液(质量分数5%)，摇匀后缓慢加入浓硫酸。分别以蒸馏水和葡萄糖溶液作为阴性和阳性对照。

1.2.2.2 碘-碘化钾实验

参考Ye等[17]的方法，向EP80溶液中加入碘-碘化钾溶液。分别以蒸馏水和淀粉溶液作为阴性和阳性对照。

1.2.2.3 Fehling实验

参考Mayank等[18]的方法，向EP80样液中加入Fehling试剂(现配现用)，置60 ℃温浴。分别以蒸馏水和葡萄糖溶液作为阴性和阳性对照。

1.2.2.4 多糖含量测定方法

采用本实验室优化的苯酚硫酸法对EP80进行定量分析[19]。以单糖浓度(mg/mL)为横坐标(x)、吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线，方程为：y= 0.034 9x+ 0.088 5，相关系数R2= 0.997 7，测得EP80多糖含量为81.3%。

1.2.3 单糖组成分析方法

采用柱前衍生化高效液相色谱法和薄层色谱法分析EP80的单糖组成[20]。

1.2.4 分子量测定方法

采用粘度计方法测定EP80的分子量[21]。使用ULA(0)型转子，温度为25 ℃，以各浓度下EP80的比浓粘度ηsp对其浓度作图，使用Mark-Houwink方程计算分子量[21]。

1.2.5 热重分析方法

在10 ℃/min的N2气氛下测定EP80在0～800 ℃区间的质量变化，研究其热稳定性[22]。

1.2.6 光谱分析方法

1.2.6.1 紫外光谱法

将淫羊藿多糖组分EP80溶于蒸馏水中，在190～500 nm波长范围内进行扫描[23]。

1.2.6.2 傅里叶变换红外光谱法

将EP80与溴化钾按1∶100比例混合研磨，然后用压片机压片，在500～4 000 cm-1波数范围内进行测定[21]。

1.2.6.3 圆二色谱法

将EP80溶于蒸馏水中，在190～400 nm波长范围内测定圆二色谱数据[24]。

1.2.6.4 刚果红实验方法

将EP80溶液与相同体积的刚果红溶液混合均匀，加入不同体积氢氧化钠溶液(1 mol/L)，使其终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol/L。在300～800 nm波长范围内测定各氢氧化钠浓度下液体的最大吸收波长[25]。

1.2.7 扫描电子显微镜法

首先剪取导电胶粘于金属托盘上，然后蘸取EP80样品粘于导电胶上，再用粉尘球吹走多余样品，而后将托盘置于真空喷镀仪内进行喷金处理，最后进行电镜观察[26]。

1.2.8 体外抗氧化实验方法

1.2.8.1 DPPH分析

参考Cao等[27]的方法，配制DPPH的乙醇溶液，分别将1 mL的DPPH和2 mL的梯度浓度多糖组分溶液(0.005、0.010、0.020、0.010、0.060、0.080和0.100 mg/mL)混合均匀，37 ℃避光反应，之后在517 nm处测其吸光度。用等量蒸馏水取代多糖溶液作为空白组，用抗坏血酸(Vc)作为阳性对照组。以多糖组分质量浓度(mg/mL)、DPPH自由基清除率平均值分别为横、纵坐标绘图。清除率计算公式：

DPPH的清除率=

[1 - (As-Aa) /Ab] × 100%

式中，As：样品或阳性对照吸光度；
Ab：空白吸光度；
Aa：对照吸光度。

1.2.8.2 ABTS分析

参考Medlej等[28]的方法，将ABTS溶液与过硫酸钾溶液等体积混匀，避光反应12 h后，取混合液加入无水乙醇，制得ABTS工作液。分别将4.75 mL的ABTS工作液与0.25 mL的梯度浓度多糖组分溶液(0.100、0.200、0.400、0.600、0.800和1.000 mg/mL)混合，37 ℃避光反应后，于734 nm处测其吸光度。用等量蒸馏水取代多糖溶液作为空白组，用抗坏血酸作为阳性对照组。以多糖组分质量浓度(mg/mL)、ABTS自由基清除率平均值分别为横、纵坐标绘图。清除率计算公式：

ABTS的清除率 =

[1 - (As-Aa) /Ab] × 100%

式中，As：样品/阳性对照吸光度；
Ab：空白吸光度；
Aa：对照吸光度。

1.2.9 酶学实验方法

1.2.9.1 乙醇脱氢酶实验

参考Madhusudhana等[29]的方法测定ALD活力，简述如下：取焦磷酸钠缓冲液1.5 mL(pH=8.8)，加入乙醇溶液0.5 mL、氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)溶液1.0 mL和EP80溶液0.1 mL，混匀后置25 ℃温浴10 min。温浴结束后立即加入乙醇脱氢酶溶液0.1 mL，摇匀后在340 nm下测定吸光度并计算酶活力和激活率。以蒸馏水为对照。

1.2.9.2 乙醛脱氢酶实验

使用ACD活性检测试剂盒测定酶活力和激活率。以蒸馏水为对照。

1.2.10 试验设计和数据处理方法

每个实验重复2～3次，取平均值。用Microsoft Office Excel 2016软件对实验数据进行录入、计算，用圆二色光谱仪自带软件分析圆二色谱数据，用Origin 2018软件绘图，用热分析系统自带软件进行热重分析。

2.1 淫羊藿多糖组分EP80的理化性质

本研究从箭叶淫羊藿中分离出3种不同分子大小的多糖新组分：EP40、EP60和EP80(见图1)。其中，EP80的抗氧化活性较强，对酒精代谢相关酶乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶的激活作用最好(参见后文)，因此对其性质、结构和功能进行了进一步探究。

2.1.1 Moilsh实验、碘-碘化钾实验与Fehling实验分析

EP80样品为棕褐色固体，凝胶过滤分析呈现单一峰形(见图2)，说明其为均一组分，纯度符合要求[16]。Moilsh实验中，EP80样品产生了紫色圆环，证明其为糖类化合物。碘-碘化钾实验中，EP80样品没有呈现蓝色，证明其中不含有淀粉。Fehling实验中，EP80样品没有形成砖红色沉淀，证明其为非还原糖。

图2 EP80的Sephadex G-100凝胶层析洗脱曲线Fig.2 Elution curve of EP80 using Sephadex G-100 gel chromatography

2.1.2 单糖组成与分子量测定

采用柱前衍生化高效液相色谱法从EP80中鉴定出半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和木糖4种单糖，薄层色谱分析也发现EP80图谱中存在半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和木糖斑点，这些说明EP80由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和木糖4种单糖组成。EP80的比浓粘度随浓度变化趋势如图3所示，其分子量为3.2×104Da。

2.1.3 热重分析

由图4可见，在30～200 ℃范围内，随着温度的增加，EP80样品质量逐渐降低。多糖中通常含有羟基等亲水基团，能够吸附部分水分，当温度增加时，水分会随之蒸发，从而导致样品质量降低。在247～353 ℃范围内，随着温度的增加，样品质量急剧下降，损失率可达50%以上。多糖分子在高温下可能出现解聚或分解，生成小分子寡糖、单糖甚至二氧化碳等，气体泄出后样品质量减小。总体上看，EP80的热失重区间主要集中在240～350 ℃范围内，总失重率超过50%。

图3 EP80的比浓粘度与浓度关系Fig.3 Relationship of EP80 between viscosity and concentration

图4 EP80的热重分析Fig.4 Thermogravimetric analysis of EP80

2.2 淫羊藿多糖组分EP80的结构特征

2.2.1 紫外光谱

多糖组分EP80在190～500 nm波长范围内的吸收光谱如图5所示。可以看出，EP80样品在260、280 nm处无明显吸收峰，说明其中不含游离蛋白质和核酸杂质[10]。

图5 EP80的紫外光谱Fig.5 Ultraviolet spectrum of EP80

2.2.2 傅里叶变换红外光谱

由EP80的红外光谱可见，该样品具有多糖的特征吸收峰(见图6)。在波数3 442 cm-1附近有较宽的吸收峰，属于多糖环上的O-H伸缩振动峰，提示样品分子内和分子间含有氢键[30]。波数2 920 cm-1附近的吸收峰属于C-H不对称伸缩振动特征峰，而1 325 cm-1附近的吸收峰属于糖类物质的C-H变角振动峰，提示样品分子内含有甲基和亚甲基基团(见图6)。波数1 145 cm-1附近的吸收峰较宽，属于C-O-C不对称伸缩振动峰，提示样品分子中含有多糖类物质。波数1 593 cm-1附近的吸收峰属于C=O收缩振动峰。波数1 050～1 145 cm-1范围存在较弱的C-O-C以及C-H-O伸缩振动吸收峰，说明EP80样品含有吡喃糖苷结构[31]。

图6 EP80的傅里叶变换红外光谱Fig.6 Fourier-transform infrared spectrum of EP80

2.2.3 圆二色谱

圆二色谱可以反映EP80的二级结构(见图7)。可以看出，EP80在230 nm附近有一个较大的正吸收峰，存在正Cotton效应，而在260 nm附近有一个较大的负吸收峰，存在负Cotton效应，提示EP80存在不对称结构，并且可能具有螺旋结构[32]。

图7 EP80的圆二色谱Fig.7 Circular dichroism of EP80

2.2.4 扫描电镜分析

由图8可见，EP80的微观形貌呈不规则片状，

图8 EP80样品的扫描电镜图谱(×400和×1 000)Fig.8 Scanning electron micrographs of the same sample of EP80 (×400 and ×1 000)

有突出的褶皱结构，说明多糖分子间有一定的排斥力，吸引力较弱。此外，淫羊藿多糖的部分表面呈卷曲状，表面较为粗糙并且存在一些细小的碎屑状颗粒，提示样品可能存在物理吸附现象。

2.2.5 刚果红实验分析

由图9可见，刚果红与EP80混合作用后，最大吸收波长发生了明显的红移，这可能是由于具有三股螺旋结构的多糖在碱性条件下发生螺旋卷曲所致[33]。刚果红实验结果进一步印证了圆二色谱实验的部分结果，说明EP80具有三股螺旋结构。

2.3 淫羊藿多糖组分EP80的抗氧化活性

2.3.1 对DPPH自由基的清除能力

如图10所示，EP80对DPPH自由基的清除率随着其浓度的升高而增高，呈现出明显的剂量依赖关系。当EP80浓度超过0.029 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率可达50%以上(见表1)，当EP80浓度超过0.060 mg/mL时，清除率高达80%以上(见图10)，提示EP80具有较好的DPPH自由基清除能力。

图9 EP80与刚果红反应体系的最大吸收波长Fig.9 Maximum absorption wavelength of complex of Congo-red reagent and EP80

图10 EP80的DPPH自由基清除能力Fig.10 DPPH radical-scavenging capacity of EP80

表1 EP80与自由基清除率量效关系数学模型

2.3.2 对ABTS自由基的清除能力

如图11所示，当EP80浓度在0～0.600 mg/mL范围时，其对ABTS自由基的清除率随着EP80浓度的增加而迅速升高，当浓度在0.600～1.000 mg/mL范围时，清除率不再明显增加。当EP80浓度超过0.235 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除率可达50%以上(见表1)，当浓度超过0.600 mg/mL时，其清除率高达90%以上(见图11)，提示EP80对ABTS自由基具有一定的清除能力。

图11 EP80的ABTS自由基清除能力Fig.11 ABTS radical-scavenging capacity of EP80

2.4 淫羊藿多糖组分EP80对酒精代谢相关酶活力的影响

2.4.1 乙醇脱氢酶

淫羊藿多糖组分EP80对ALD的激活率随着多糖组分浓度的增大而增加，呈现出明显的剂量依赖关系(见图12)。EP80浓度与乙醇脱氢酶活性激活率之间量效关系拟合方程的相关系数为0.9576(见表2)，说明该方程拟合度较好。EP80的半有效浓度(EC50)为3.75 mg/mL，提示其浓度大于3.75 mg/mL时，ALD的激活率可达50%以上。EP80的EC50低于EP40(6.21 mg/mL)和EP60(7.16 mg/mL)(P<0.05)，说明EP80对ALD的激活作用强于EP40和EP60。

图12 EP80对乙醇脱氢酶激活率的影响Fig.12 Effect of EP80 on activation rate of alcohol dehydrogenase

表2 EP80浓度与酒精代谢相关酶激活率之间的量效关系

2.4.2 乙醛脱氢酶

由图13可见，随着淫羊藿多糖组分EP80浓度的增大，ACD激活率逐渐增加，显示出明显的剂量依赖性。由表2可知，当EP80浓度超过6.48 mg/mL时，ACD的激活率接近100%。EP80对ACD的激活作用强于EP40和EP60。ALD和ACD是酒精进入人体后分解代谢的重要酶，EP80对ALD和ACD均表现出较好的激活作用，提示其在解酒保肝中具有一定的潜在应用价值。

由表2还可看出，EP80对ACD激活作用的EC50明显低于其对ALD的EC50(P<0.01)，提示其对ACD的激活作用强于ALD。在酒精分解代谢过程中，ALD将酒精氧化成乙醛，ACD将乙醛进一步氧化成乙酸。乙酸安全性较高，而乙醛在人体积累可能导致染色体损坏、干细胞突变或肝损伤等[34]。一般认为，ACD在减除酒精毒害中发挥的作用强于ALD[9,35]。本研究发现，EP80对酒精代谢相关酶具有激活作用，特别是其对ACD的激活作用更强，这样有助于减轻酒精代谢产生的乙醛对人体的伤害。

图13 EP80对乙醛脱氢酶激活率的影响Fig.13 Effect of EP80 on activation rate of acetaldehyde dehydrogenase

本研究从药用植物箭叶淫羊藿中分离制备了多糖新组分EP80，采用紫外光谱、傅里叶变换红外光谱、圆二色谱、刚果红实验、扫描电镜、热重分析等方法对EP80进行了结构表征，并考察了其体外抗氧化能力以及对酒精代谢相关酶乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活力的影响。结果表明，EP80由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和木糖4种单糖组成，分子量为3.2×104Da，具有吡喃糖苷骨架，含有三股螺旋结构，在230 nm附近有正Cotton效应，在260 nm附近有负Cotton效应，微观形貌呈不规则片状，有突出的褶皱结构，热失重区间主要集中在240～350 ℃。EP80具有一定的抗氧化活性，对乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶具有明显的激活作用，对乙醛脱氢酶的激活作用强于乙醇脱氢酶，值得进一步研究。本研究为淫羊藿多糖的开发利用提供了参考。