基于含量测定和指纹图谱的远志药效物质累积规律研究

李建丽，李 慧，李慧峰，程艳刚，王佳敏，田洪岭，王颖莉*

1山西中医药大学中药与食品工程学院，晋中 030619；
2山西省农业科学院经济作物研究所，汾阳 032200

药效物质累积规律与药材生长年份、采收时间有密切关系，二者对药材本身的质量、疗效有直接的影响，所以选择合适的采收时间是保证药材有效性的关键所在，对药材药效物质累积规律的研究可为其种植采收提供参考依据，可以保证药效物质的含量，进而保证药效。远志的生长种植年份，多以3年生为主[9]，一般在种植满两年后的10月或第二年3、4月采收[10,11]。《中华人民共和国药典》规定远志在春、秋二季采挖，虽对采收期进行规定，但无生长年限要求。远志野生资源匮乏，是国家三级野生保护植物，当前流通多为远志栽培品。山西是远志的道地产区，市面所售80%远志产自山西。栽培资源主要集中于山西新绛、闻喜、洪洞等地[12]。

本研究利用定量和指纹图谱法对远志进行综合考察，探讨远志不同产地、生长年份、采收时间与其药材的长度、直径、含水量、浸出物及含量测定等多方面累积规律的关系，以期对远志药材选种、种植、采收提供科学依据。

1.1 仪器

Waters 2695高效液相色谱仪、Waters 2998 PDA检测器(沃特世科技有限公司)；
Alltech ELSD 2000ES检测器；
Waters XSelect CSH C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；

SMART-NE纯水仪(力康生物医疗科技控股有限公司)；
KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
RE-5298旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 材料

从山西汾阳、新绛采集了12批不同远志药材(采收时间分别为2021年春4月、秋10月)，经山西中医药大学裴香萍教授鉴定为远志科植物远志PolygalatenuifoliaWild.。原植物标本保存于山西中医药大学山西省现代中药工程实验室,其详细信息见表1；
PX Ⅲ对照品(批号：P27A11S122507，纯度≥98%；
上海源叶生物科技有限公司)；
DISS对照品(批号：YZM2-XPU0；
含量96.6%；
中国食品药品检定研究院)；
TEN对照品(批号：R23N8F49013；
纯度≥98%；
上海源叶生物科技有限公司)；
色谱级甲醇、乙腈(瑞典Oceanpak公司)。无水乙醇、正丁醇、甲醇、氢氧化钠等试剂均为分析纯。

表1 远志信息表

续表1(Continued Tab.1)

2.1 检查

2.1.1 水分检查

远志采收后，除去附着泥沙，平铺于地面，室温通风阴干，2天后再次除去干燥泥沙，抽取木芯，继续通风阴干远志筒，至药材干燥易折断，收集得到待测远志药材。秋采与春采干燥方法和时间相同。按照2020版《中华人民共和国药典》的通则0832热烘法进行水分测定，计算药材中含水量(%)，数据记录见表2。

12批药材含水量均小于12%，符合要求。新绛产6批药材含水量均高于汾阳，各相同生长年份的汾阳产与新绛产药材水分含量差异均有统计学意义(P<0.05)；
两地产春采与秋采药材水分含量差异不明显。

2.1.2 浸出物检查

按照2020版《中华人民共和国药典》的通则2201项下的热浸法，用70%乙醇作溶剂，计算浸出物的含量(%)，数据记录见表2。

表2 远志药材含水量、浸出物含量

12批远志浸出物含量均大于2020版《中华人民共和国药典》规定的30%。由图1可知，汾阳产春采药材浸出物含量随着生长年份的增加而升高，趋势明显，新绛产春采药材浸出物含量随着生长年份的增加而降低，与汾阳产趋势相反。两地秋采药材浸出物含量与生长年份均不具有明显的增加或减少趋势。两地各生长年份、采收季节相同的药材相比，新绛产浸出物含量较高。新绛秋采药材浸出物含量低于春采。

2.2 远志指标性成分的含量测定

2.2.1 溶液的制备

取PX Ⅲ、DISS对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含PX Ⅲ 0.15 mg、DISS 0.2 mg的混合对照品溶液；
取TEN对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含TEN 1 mg的溶液，得对照品溶液。

图1 远志药材浸出物含量变化Fig.1 Changes of extract content of Polygalae Radix注：左图为汾阳产；
右图为新绛产。Note:Left:Fenyang production;Right:Xinjiang production.

PX Ⅲ、DISS和TEN供试品溶液均严格按照2020版《中华人民共和国药典》含量测定项下各方法步骤制备。

2.2.2 色谱条件

PX Ⅲ、DISS含量测定的色谱条件：Waters XSelect CSH C18色谱柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；
流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～19 min，15%A；
19～19.5 min，15%→18%A；
19～60 min，18%A)；
柱温30 ℃；
检测波长320 nm；
进样体积10 μL；
体积流量1.0 mL/min。对照品、样品色谱图见图2。

TEN含量测定的色谱条件：Waters XSelect CSH C18色谱柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；
流动相为乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)，等度洗脱(0～20 min，38%A)；
柱温30 ℃；
进样体积10 μL；
体积流量1.0 mL/min，ELSD漂移管温度110 ℃；
气体流速：2.1 L/min，对照品、样品色谱图见图3。

图2 PX Ⅲ、DISS对照品(A)及样品(B)色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of PX Ⅲ,DISS reference substances (A) and sample (B)

图3 TEN对照品(A)及供试品(B)色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of TEN reference substance (A) and sample (B)

2.2.3 方法学验证

线性关系考察：取“2.2.1”项下的对照品溶液的不同体积，按“2.2.2”项色谱条件测定，记录色谱峰峰面积，以峰面积Y为纵坐标，进样量X(μg)为横坐标，得到标准曲线。PX Ⅲ、DISS、TEN标准曲线的线性方程分别为Y= 1 577 068.928X- 370 244.988 ，R2= 0.995；
Y= 2 506 214.075X- 749 554.703，R2= 0.994；
Y= 339 807.092X+ 63 135.823，R2 = 0.999。表明PX Ⅲ、DISS、TEN进样量分别在0.72～2.70、0.96～3.60、4.86～24.30 μg内有良好的线性。

精密度、稳定性、重复性实验取“2.2.1”项下溶液，按“2.2.2”项色谱条件测定，精密度以对照品溶液重复进样6次；
重复性以S-1-3制备6份供试品溶液分别进样，稳定性以S-1-1供试品溶液考察24 h内稳定性。考察结果表明仪器精密度高；
重复性实验显示，PX Ⅲ、DISS和TEN平均含量分别为1.10、8.48和24.60 mg/g，三者含量的RSD分别为和0.84%、0.85%和2.56%，重复性好；
样品24 h内稳定。其保留时间和峰面积RSD结果见表3。

表3 精密度、重复性、稳定性实验结果(n=6)

加样回收率：精密称取已知PX Ⅲ、DISS含量的S-1-2样品干燥粉末约1 g，共6份，精密加入PX Ⅲ、DISS浓度分别为0.120 5、0.112 7 mg/mL的混合对照品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算PX Ⅲ、DISS平均回收率分别为99.13%、99.71%，RSD分别为1.50%、1.58%。精密称取已知TEN含量的S-1-2干燥粉末约1 g，共6份，精密加入浓度为1.030 5 mg/mL的TEN对照品溶液1 mL，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算TEN的平均回收率为99.86%，RSD为1.46%，表明方法准确度良好，结果见表4。

表4 加样回收率结果

2.2.4 样品含量测定

取12批药材，各平行取3份，按照“2.2.1”项制备供试品溶液，按照“2.2.2”项色谱条件进样，测定峰面积，分别计算PX Ⅲ、DISS、TEN在样品中的含量，结果见表5。

表5 远志三种指标性成分的含量测定

结果表明，12批药材中DISS含量均大于《中华人民共和国药典》规定的0.5%。汾阳产春采DISS含量高于秋采，但不具有统计学意义，在种植3年后含量累积达到最大。新绛产春采DISS含量高于秋采，春采药材与汾阳产有类似的累积规律，在3年后达到最大累积含量；
秋采中DISS随着生长年限的增加，含量逐渐增加。

汾阳、新绛产PX Ⅲ 含量与生长年份的关系不太明显，两地相同生长年份秋采PX Ⅲ 含量较高，且均在种植3年后到峰值；
与DISS累积规律类似。

汾阳产TEN生长2年达到含量最大值，3年达到最低值，且春采TEN含量高于秋采。新绛产在生长3年含量达到最高值，规律同汾阳一致春采高于秋采；
TEN2年生含量高于4年生。

综上，两地春采样品PX Ⅲ、DISS有类似的累积规律，均在生长3年出现累积最大值，与传统的种植采收时间相符。TEN春采含量较高，且2年生高于4年生。

以上三种指标性成分的含量相加得到总含量并对其进行分析，发现汾阳产远志相同生长年份春采总含量高于秋采，秋采药材随着生长年份的增加总含量逐年减少。不同采收时间的新绛产远志均在生长第三年达到总含量的最大值，有相同的累积规律，且相同生长年份春采总含量高于秋采(见图4)。

图4 远志药材三种成分总含量Fig.4 Total content of three components of Polygalae Radix注：左图为汾阳产；
右图为新绛产。Note:Left:Fenyang production;Right:Xinjiang production.

2.3 远志药材指纹图谱的建立

2.3.1 溶液的制备

取0.5 g药材，精密称定，加20 mL 70%甲醇摇匀，室温超声提取30 min(200 W，40 kHz)，用70%甲醇补足失重。过滤，即得供试品溶液。

精密称取PX Ⅲ、DISS对照品适量，制成0.1 mg/mL 的单独对照品溶液和0.1 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3.2 色谱条件

Waters XSelect CSH C18色谱柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；
流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)，梯度洗脱系统(0～10 min，10%→20% A；
10～15 min，20%→21% A；
15～20 min，21%→23% A；
20～30 min，23%→26% A；
30～40 min，26%→38% A；
40～50 min，38%→40%A；
50～70 min，40%→42% A；
70～73 min，42%→10%A)，体积流量1.0 mL/min；
检测波长316 nm；
柱温30 ℃；
进样体积10 μL。

2.3.3 色谱峰的指认与方法学考察

将对照品溶液按“2.3.2”项下色谱条件进样，记录色谱图与结果，经对照品指认，最终确认共有峰5为PX Ⅲ，峰8为DISS。峰5、8均在12批样品中出现并完全分离。对照品色谱图见图5。

图5 PX Ⅲ、DISS指纹图谱Fig.5 HPLC fingerprint of PX Ⅲ and DISS

稳定性试验：取S-2-1供试品溶液，与“2.2.3”项方法相同，按“2.3.2”项下色谱条件检测指纹图谱，获得峰5 PX Ⅲ和峰8 DISS的保留时间RSD分别为0.48%、0.62%，峰面积RSD分别为1.34%、1.03%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

重复性试验：取S-2-1药材，与 “2.2.3”项方法相同，按照“2.3.1”制备供试品溶液，按“2.3.2”项下色谱条件检测指纹图谱，获得峰5 PX Ⅲ和峰8 DISS的保留时间RSD分别为0.68%、1.06%，峰面积RSD分别为2.34%、2.63%，重复性好。

2.3.4 指纹图谱的建立与结果分析

取汾阳、新绛产共12批远志供试品溶液，以“2.3.2”色谱条件分析记录色谱图与结果，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012)”，以中位数法生成远志共有图谱，并作为参照图谱，采用多点校正、全峰匹配建立12批样品指纹图谱，样品指纹图谱见图6，系统生成的对照指纹图谱见图7。

图6 12批样品HPLC指纹图谱Fig.6 HPLC fingerprint of 12 batches of samples

图7 12批样品HPLC共有峰Fig.7 Common peaks of 12 batches of samples

样品指纹图谱相似度评价：远志12批样品共有35个共有峰，相似度介于0.823～0.962之间，见表6。两地产远志药材相似度高，其化学成分种类相似，在含量上略有差异。12批样品相同生长年份春采相似度高于秋采，汾阳产生长3年样品春采和秋采的相似度均为最低。汾阳产和新绛产样品相似度没有统计学差异，同一基源、不同产地、不同生长年份样品指纹图谱相似度高。

表6 12批样品指纹图谱相似度评价

药用植物中有效成分的含量及累积规律会受到基源、种植、采收及环境等多种因素的影响，药材生长时间的延长除对药材性状如长度、直径等造成直观影响外，对有效成分的含量影响很大，进而会影响其药效。中药材的最佳采收期应是包含采收时间和采收年限的双重概念，在其有效成分含量高、外观性状佳的时期进行采收，才能得到优质的药材，从而达到更好药效。本研究除对药材性状进行测量外，利用热浸法、HPLC，从浸出物、PX Ⅲ、DISS和TEN的含量及指纹图谱相似度等多方面对12批同一基源、不同年份、产地和采收时间的远志药材进行药效物质累积规律的研究。

12批药材醇浸出物含量均大于30%，DISS含量均大于0.50%；
以PX Ⅲ为指标，仅有S-1-4、S-1-5的含量达到0.15%；
以TEN为指标，仅S-1-1、S-2-2、S-2-5有的含量达到2.0%。文献表明，HPLC测定远志药材中PX Ⅲ的合格率在50%～80%左右[13]；
TEN含量范围为1.4%～4.4%[14-16]，与本研究的结果相近。含量测定变化区间大的原因可能有PX Ⅲ存在两种分子构型[17]和ELSD检测器灵敏度低等。远志药材中所含化学成分的多样，故以此三种化学成分的含量为指标评价远志质量的合理性与准确性仍需考量。

本研究发现新绛产远志含水量、浸出物含量和三种指标性成分总含量均高于汾阳产；
两地春采药材浸出物、成分总含量均高于秋采。山西为远志的道地产区，产区多分布于山西南部，相较于汾阳，新绛地理位置偏南，本研究表明新绛更适合远志的种植与栽培。两地远志浸出物、总成分含量与采收季节有关，均表现为春季含量较高，本研究认为相同生长年份，春季采收的远志更为合适。

药材的药效物质累积规律与其品种、产地和采收时间有密切的关系，药材采收时间的确定也要考虑到品种、产地及其不同药用部位的影响，且因治疗目的的不同可能导致不同的生长期限和采收时间。可进一步探究是否能够根据治疗疾病的药效物质基础的不同，灵活、合理、选择性地安排其采收时间。因本研究远志样品批次选取的限制性、不同批次内样本数量的有限性、所选取测定成分的合理性，本实验研究结果是否具有代表性、全面性还需进一步研究。另外，在全国范围内的其他远志种植区、不同基源远志是否具有相同的累积规律也需要深入研究，为远志的种植采收提供更有力可信的参考。