柠檬酸提取法时间对海带多糖提取率的影响及其稳定性研究

熊江燕 王琤韦华

(江西科技师范大学生命科学学院，南昌 330013)

海带是海洋中的一种经济价值和产量极高的大型褐藻，其含有多种结构不同、性质迥异的天然活性多糖成分。

其中海带多糖具有降血脂、 抗氧化、防辐射及调节免疫等多种生物活性，并在动物养殖方面实现了基于海带多糖等海带活性物质的新型饲料添加剂研发， 其在畜牧业的应用价值和经济效益不断提升。

但商品海带普遍成本高且生产工艺繁琐，因此，如何在低成本的基础上高效地提取出海带多糖就成为了畜牧业的一个研究热点。目前，采用热水浸提法、酸提取法、碱提取法和酶解法提取海带多糖的报道较多。

其中酸提取法是一种工艺简单，成本较低，而提取率又较高的海带粗多糖的提取方法。但海带的干燥方法、海带目数、提取温度、浸提液pH、提取时间及料液比等因素都会影响多糖的提取量。

本试验研究时间这一因素对柠檬酸提取海带多糖的影响， 并在此基础上比较海带多糖在强酸强碱溶液中的稳定性，为推动其在动物生产实践上的应用提供一定的参考依据。

1.1.1 试验材料

干海带购于江西科技师范大学附近市场。

1.1.2 试验试剂

柠檬酸；
葡萄糖；
浓硫酸；
氢氧化钠；
无水乙醇；
苯酚；
三氟乙酸，均为国产分析纯。

1.1.3 试验仪器

电子天平(FA-1004)，上海力辰邦西仪器科技有限公司；
恒温水浴锅(SYG-4)，上海助蓝科技有限公司；
鼓风恒温干燥箱(101-2B)，唯恒机械设备有限公司；
高速离心机(HC-2062)，安徽中科中佳科学仪器有限公司；

可见分光光度计(UV-722)，上海佑科仪器仪表有限公司；
予华牌循环水式真空泵(SHZ-DⅢ)，长沙明杰仪器有限公司；
移液枪(M-1000)，宁波市群安实验仪器有限公司。

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

分 别 取 0.00、 0.20、 0.40、 0.60、 0.80、1.00mL 100mg/L 标准葡萄糖溶液于试管中，用蒸馏水将其补至1.00mL。

分别向各试管中加入1.00mL 5%苯酚溶液、5.00mL 浓硫酸溶液， 混匀。先静置5min，后沸水浴反应15min，冷却后490nm测量各试管中溶液的吸光值。

最后绘制葡萄糖标准曲线，每组葡萄糖的质量浓度作为横坐标，相应的OD 值为纵坐标。

1.2.2 海带多糖提取工艺流程

干海带进行粉碎，pH=2 的柠檬酸溶液与海带粉末按液料比40：1(mL/g)在100℃水浴中分别浸提1h、2h、3h、4h、5h， 浸提液用6 层纱布过滤，5000r/min 离心10min， 取上清液加入氢氧化钾调节pH 为中性，浓缩，分3 次醇沉(乙醇最终浓度为80%)，醇沉后进行抽滤得沉淀，洗涤脱水后用恒温鼓风干燥箱烘干得海带粗多糖。

1.2.3 稳定性试验

称取0.2000g 左右海带粗多糖， 分别加入5.00mL 4mol/L 的三氟乙酸、氢氧化钾溶液，一组加入5.00mL 蒸馏水作为对照组。

三组混合液于60℃保温6h， 冷却后将pH 调至中性并定容至10.00mL。

取1mL 混合液， 向各试管中 加入1.00mL 5%苯酚溶液、5.00mL 浓硫酸溶液， 混匀。首先室温静置5min，然后沸水浴反应15min，冷却后用可见分光光度计在490nm 测得OD 值。

1.3.1 提取率

烘干后的粗多糖用蒸馏水进行溶解并稀释一定倍数， 后参考文献采用苯酚-硫酸法在490nm下测定吸光度， 所得吸光度值代入葡萄糖标准曲线计算多糖含量再根据以下公式计算提取率：

提取率=浸提液中多糖含量/所用干海带粉末的质量*100%

1.3.2 稳定性

将经酸碱处理后的溶液及对照组测定吸光度，将吸光度值代入葡萄糖标准曲线计算多糖含量：

稳定率=处理后多糖含量/未处理多糖含量*100%

使用Excel 对所有数据进行初步处理。

柠檬酸在不同的浸提时间下， 海带多糖的提取率如表1 所示。由图1 可知，海带多糖的提取率随着浸提时间的增长，呈先上升再下降的趋势。当提取时间为4h 时， 多糖得率最高， 达到了39.05%，而超过4h 后，多糖得率开始降低，表明柠檬酸提取海带多糖的最佳浸提时间为4h。

表1 海带多糖的提取率

图1 柠檬酸浸提不同时间的海带多糖得率

在强酸与强碱溶液中海带多糖的稳定性如表2 所示。

由表2 可知， 与在水溶液中的对照组相比，海带多糖在强酸性溶液中，稳定性较好，稳定率为88.51%，而在强碱性溶液中，海带多糖的稳定性较差，稳定率为52.57%，表明海带多糖的酸稳定性显著高于碱稳定性。

表2 海带多糖的稳定性

酸提法是一种传统的提取海带多糖的方式，酸提取法的原理是通过酸液的作用， 使海带细胞壁充分膨大破裂，进而使海带多糖游离出来。周裔彬等实验在提取海带多糖的传统工艺基础上发现了通过适当增加料液比、 提高浸提的温度或合理延长浸提的时间而将柠檬酸溶液的作用发挥得更充分， 使其细胞壁充分吸水膨胀以致破裂的一种酸提法的优化方式， 这样可以使海带多糖类化合物充分游离出来，达到纯化及提高提取率的目的，提取率最高可达35.10%。

王智荣等用柠檬酸提取海带多糖，通过单因素试验及正交试验，表明显著影响海带多糖得率的因素大小依次为：pH ﹥提取液料比﹥提取时间﹥提取温度。

本试验研究结果表明， 柠檬酸提取海带多糖的最佳浸提时间是4h，在此条件下多糖得率是39.05%。

这可能是由于酸提取法可以有效防止褐藻胶溶出， 使浸提液中有较高的褐藻糖胶含量；

且由多糖的特性即它的粘度可以看出，酸提法的粘度远小于水提法，说明酸提取法引起多糖分子的部分降解，4h 时海带中的多糖基本上全部溶出， 继续增加提取时间会破坏多糖结构。试验数据显示，在3-4h 内，海带多糖提取率变化较小， 因而从成本、 环保节能的角度出发，提取时间应控制在3h 与4h 之间。

目前，研究发现海带中主要存在褐藻胶、褐藻糖胶、褐藻淀粉这三种多糖。由于海带多糖是高度聚合的天然高分子化合物， 而褐藻胶分子是线性聚合物，其聚合度越高相应的分子链也越长，粘度也就越高，属于典型的胶体。粘性大并有良好的成膜性质使其可以起到稳定蛋白质的作用， 因而海带多糖在新型饲料添加剂的研发方面具有广阔前景。但由于外界条件或产品质量的影响，褐藻胶的线性分子会发生自然解聚的现象， 造成分子链逐渐断裂使粘度降低， 通常粘度下降率越小表示其稳定性越好。试验证明，褐藻胶溶液的粘度及其稳定性在pH 值维持在4～10 范围内基本不受pH 的影响， 特别是溶液为中性时褐藻胶的粘度可保持较稳定的状态。

其原理是分子结构的羧基会产生排斥作用，导致羟基所存在的分子链延长，从而增强了它与水的相互结合，保持一定的稳定状态。在褐藻胶的制造工艺中中和褐藻酸时因用碱量不足或过多(pH 值降低或增高)使溶液未完全中和等原因，均会产生游离碱和褐藻酸。若溶液中存在处于游离状态的褐藻酸， 褐藻酸的酸性会使它的水解先于中性盐；
而当溶液偏碱性时(此时pH 值大于10)也会促使褐藻胶的降解。

本试验结果表明，海带粗多糖在强酸溶液中的稳定性为88.51%，显著高于在强碱溶液中的稳定性。

何粉霞等研究也表明海带多糖在极端酸性条件下稳定率在95%左右，在极端碱性条件下稳定率会下降。

本试验研究表明， 柠檬酸的浸提时间会显著影响海带多糖得率， 且海带粗多糖在强酸溶液中的稳定性高于在强碱溶液中的稳定性。因此，为降低动物养殖成本， 柠檬酸提取法用于工业生产海带粗多糖时浸提时间不宜过长， 且作为一种理想的饲料添加剂， 其良好的化学稳定性也有利于保持抗肿瘤、降血脂、提高免疫力及作为精液冷冻剂等生理功能。

参考文献(略)