免疫检查点抑制剂治疗结直肠肿瘤相关研究进展

张娟学，叶玉伟，张军，郑亚，王玉平，姬瑞

【提要】 免疫检查点抑制剂治疗在MSI结直肠肿瘤治疗中获得了良好的效果，针对提高免疫检查点抑制剂疗效目前已提出了比如新抗原，癌症疫苗、Hp感染、肿瘤突变负荷、HLA-Ⅰ类、Ⅱ类蛋白丢失、肿瘤微环境、肠道菌群等相关概念，旨在尽可能全面探索免疫检查点抑制剂耐药机制，并为寻找疗效相关新的肿瘤标志物，实现癌症个性化治疗提供思路，本文就上述方面的研究进展作一综述。另外，ICI治疗在MSS CRC中结果不尽如人意，未来希望有更高效的免疫疗法出现。

人体免疫系统被认为是抵御各种外来病原体的保护屏障，T细胞在肿瘤免疫中发挥重要作用。免疫检查点是表达和调节免疫细胞活化的分子，当免疫反应太强时，免疫检查点充当衰减调节器。癌细胞过度表达 PD-L1与 PD-1相互作用，促使 T 细胞失活，导致恶性细胞免疫逃逸[1]。ICI[2]构成成熟的单克隆抗体免疫疗法，研究最广泛的免疫检查点是 PD-1(programmed cell death 1)和CTLA-4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4细胞毒T淋巴细胞抗原4)，也有关于其他检查点在肿瘤免疫调节中潜在作用的研究，如LAG-3(lymphocyte activation gene-3 淋巴细胞激活基因3)、Tim-3(T cell immunoglobulin-3 T细胞免疫球蛋白3)、T细胞免疫球蛋白和TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域)[3]。目前 FDA 批准用于 CRC 的 PD-1 和 CTLA-4 抑制剂共有三种：派姆单抗、纳武单抗和易普利姆玛。CRC[4]是全球女性中第二常见的癌症，也是男性中第三常见的癌症[5]，约占所有癌症死亡人数的 9%。饮食、环境暴露以及各种因素，例如与家族史或慢性炎症相关的易感等位基因及预先存在的突变，新突变的积累，都会导致 CRC。

基于相关的基因表达特征，提出了四种CRCs共有分子亚型(CMSs)[6]。CMS1或MSI-H的特点是超突变、微卫星强且不稳定的免疫激活。IHC发现CMS2-4(MSS)中HLA-I普遍缺失或下调，其中CMS4中更多见。CMS2肿瘤中WNT/β-连环蛋白/MYC 信号抑制HLA-I和APM基因表达，引起CRC免疫排斥。CMS3肿瘤以代谢失调为特征，富含KRAS突变，抑制 IFN-γ(STAT1、STAT2、IRF2)信号传导，导致 MAPK通路激活，降低CRC 肿瘤中HLA-I和 APM(TAP-1、LMP2、LMP7)表达。CMS4 肿瘤的特征是基质侵袭、TGF-β 激活、血管生成，高水平的 M2 巨噬细胞和调节性 T 细胞，预后不良，多见于疾病晚期(Ⅲ-Ⅳ期)[7]。

不同亚型的 CRC包含四种基因组和表观基因组不稳定性，包括染色体不稳定性(CIN)、CpG 岛甲基化表型 (CIMP)、微卫星不稳定性 (MSI) 和 DNA 全局低甲基化[8]。CIN 通路负责 75%～80% 的散发性CRC的发展，由一系列遗传改变引起，涉及原癌基因(K-RAS)的激活和抑癌基因(TP53、APC、SMAD2 和 SMAD4)的失活。错配修复(MMR)是识别和修复DNA聚合酶在复制过程中DNA碱基插入、缺失和错配的重要机制。常见的MMR 基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的突变或表观遗传沉默导致 MSI，其特点是微卫星的短串联重复 DNA 序列的基因高突变率[9]。

CRC是一种异质性疾病，由于dMMR和体细胞突变[10]，15%的CRC肿瘤出现MSI-H，其余病例属于MSS 组[11]。在 CRC 肿瘤以及其他实体瘤中存在dMMR-MSI-H是对 ICI 治愈反应的有效生物标志物[7], 因而建议对所有mCRC患者进行MSI状态检测。另外，MSI 状态似乎与患者年龄相关[9]。大量 T 细胞浸润和 IFNγ以及 PD-1 和 PD-L1 的表达，代表了预先存在的抗肿瘤免疫指标，是对 ICB 反应的有利预测因素，并非所有 CRC 患者都对 ICI 反应良好，骨髓细胞表达免疫检查点配体，作为逃避免疫介导杀伤的一种手段，许多患者内在特征(例如，年龄、性别、HLA 基因型和遗传多态性)和肿瘤内在决定因素(例如肿瘤突变负荷[12]和 TME 组成)与ICB敏感性相关[13]。因此评估免疫治疗反应中更精确和可靠的预测性生物标志物以及克服耐药机制实现精准医疗的个性化方案[14]刻不容缓。新抗原[15]是肿瘤进化过程中非同义体细胞突变的结果。具有大量亚克隆突变的肿瘤具有多种不同基因组的细胞群，表型特征不一。新抗原仅存在癌细胞中，不受中枢免疫耐受的影响。肿瘤细胞表达免疫系统识别的免疫原性抗原，ICB 可能是有效的。这些独特性使新抗原不仅成为治疗性癌症疫苗的优秀候选者[16]，也与ICI和 CAR-T治疗相关。然而，大多数癌症新抗原具有无法检测到的免疫原性，肿瘤突变负担低，需要开发一种可以增强新抗原的免疫原性以实现有效的癌症免疫治疗方法。

MLH1的甲基化导致dMMR和MSI-H，并在 CIMP 环境中通过BRAF、PTEN和TGFβRII的突变而进展。约 33% 的MSI-H CRC患者患有 Lynch 综合征或遗传性非息肉病 CRC。dMMR-MSI-H CRC 肿瘤具有独特的病理表型及基因特征。MMR基因之一失活即使突变率增加 20 倍，超过 80% 的病例出现高TMB，突变肽出现在 MHC I分子上，导致高密度的CD8+T 细胞、Th1 CD4+T淋巴细胞[19]、巨噬细胞和 IFN-γ，肿瘤产生的免疫反应表现为使中性粒细胞、PLT、CRP水平升高被称为类克罗恩病，预后良好。MSI-H 肿瘤倾向于上调 T 细胞抑制性配体表达，为逃避免疫介导杀伤。因此，ICIs 利用MSI-H CRC预先存在的炎症微环境来拮抗其 T 细胞抑制剂信号并导致其细胞毒性破坏。MSI-H CRC 患者的总生存期更佳，Ⅲ期CRC中相关死亡人数下降了 60%，并且不易发生远处转移。然而，如果 dMMR-MSI-H CRC 肿瘤在初始治疗后转移或复发，预后可能比pMMR-MSI-L mCRC更差[20]。

pMMR-MSI-L即 (MSS) 肿瘤因APC 基因失活、KRAS突变，随后是SMAD4和TP53失活，其TMB较低，每 106 个 DNA 碱基的突变率低于 8.24 个，并且被 T 细胞或抑制性配体表达细胞浸润很差，并不能单独从 ICB 治疗中受益。但2%～3%的MSS肿瘤表现出以大量移码突变为特征的超突变表型[21]，该表型由于参与 DNA 复制和修复的 DNA 聚合酶 epsilon 或 delta (POLE, POLD) 失活所致，肿瘤内也富含CD8+T 细胞和CD68+巨噬细胞并表达高水平的促炎细胞因子和免疫检查点[22]，表明可以使 ICB 受益，最近首例报道了患有 POLE 突变的 MSS 转移性 CRC对 pembrolizumab 产生临床反应，这突出了识别 MSI 状态和超突变表型作为对ICI的预测标志物的临床意义。

MHC I类、II类蛋白丢失[23]，β2M[24]基因异常以及 IFN 信号通路引起肿瘤耐药。MAPK 通路的异常激活与前两者相关， MSI-H CRC中常见， HLA-I的丢失是肿瘤发展自然史中的关键步骤，丢失HLA-Ⅰ使 T 细胞无靶点[25]。正常肠上皮、早期MSI-H 和 MSS 腺瘤是 HLA-Ⅰ阳性，随后在 HLA-Ⅰ和 β2m 基因中积累突变和杂合性缺失 (LOH)，最后免疫压力导致 HLA-Ⅰ丢失。使用表观遗传修饰剂可以恢复 HLA-Ⅰ表达。HLA-Ⅱ表达不仅限于专业APC，还可以在生理条件下由上皮细胞或在某些情况下被促炎细胞因子(包括 IFN-γ)表达，另外HLA-Ⅱ可以在包括CRC在内的不同来源的肿瘤上表达，预后良好。HLA-DR 是在 CRC 肿瘤中表达的主要 HLA-Ⅱ分子，在MSI-H CRC 中表达频率更高。B2M 突变MSI-H CRC 患者具有良好的预后,与之前报道不一致。

近年来，针对“左右结直肠癌之争”出现了不同的靶向治疗，然而在 KRAS、NRAS 或 BRAF 基因突变的 CRC 中不起作用。此外，小分子抗血管口服药物甲磺酸阿帕替尼的出现使CRC治疗多样化,然而Ⅰ/Ⅱ期CRC病死率为8%～13%，Ⅲ期为11%～47%，Ⅳ期高达89%。单独抑制MAPK激酶(MEK)可刺激肿瘤周围 T 细胞的克隆扩增并增强抗 PD-L1 活性[26]。目前正在分析 MEK 抑制剂联合 ICI 治疗 MSS CRC 的效果；
低剂量的放射和化学疗法,可增强新抗原相关T 细胞的抗原呈递和肿瘤消除[27]，小鼠结肠腺癌的免疫治疗只有在放疗之前才能成功[7]。

TME[29-30]由肿瘤细胞和基质微环境组成[31]，形成免疫抑制性炎症状态，诱导血管生成，募集Tregs 和髓源性抑制细胞 (MDSCs)，影响肿瘤分化、迁移。肿瘤与其TME之间的相互作用是双向且复杂的[32]，TME 还支持肿瘤异质性，增加了CRC患者间和肿瘤内复杂性[33]。此外，TME中较高水平的 CD8+T细胞通常与更好的预后相关，较高水平的M0巨噬细胞、CD4+T细胞和较低水平的DC则意味着预后较差。CRC中的TME受肿瘤发展过程中体细胞突变和表观遗传事件以及宿主免疫系统的影响，是影响癌症免疫治疗的重要因素，长期使用抑制炎症的药物如阿司匹林可以降低家族性结肠息肉患者癌变风险[34]。

2.1 PD-1是一种在多种造血细胞系表面表达的跨膜蛋白[35]，属于免疫球蛋白基因CD28超家族的新成员。PD-L1/PD-1 轴通过抑制下游激酶和减少细胞因子产生诱导信号级联反应，抑制癌细胞凋亡并刺激效应T 细胞转化为Tregs。PD-1 有两个配体，PD-L1 (B7-H1/CD274) 和 PD-L2 (B7-DC/CD273)，均抑制 T 细胞增殖和细胞因子产生[36]。PD-L1位于肿瘤-基质界面，是肿瘤细胞结合 T 细胞上 PD-1 和 CD80的主要配体，而 PD-L2 在活化的单核细胞、巨噬细胞和DC上选择性表达。PD-1或PD-L1 的表达是否能预测 ICI 的有效性是有争议的，TIMCs 中 PD-L1 表达预后较好[37]。

2.2 CTLA-4，也称为 CD152，一种抑制免疫反应的蛋白质受体，主要在活化的 T 细胞上表达，1987 年首次被克隆，通过结合APC上的 B7-1 (CD80) 和 B7-2 (CD86) 配体，有助于磷酸酶活化并抑制T-regs 的失活、引起克隆扩增和抗肿瘤排斥反应[38]。

2.3 TAM对于肿瘤微环境的形成很重要，除了促进肿瘤发生之外， 还可以深刻影响对抗癌疗法的反应。巨噬细胞的巨大异质性和可塑性[39]以及来自微环境的大量调节信号， M2型与M1型之间发生转换影响邻近肿瘤，这种影响具有两面性[40]。然而，具有不同表型的巨噬细胞在 CRC 中的确切作用仍在研究中。中山等人的研究表明大量的CD68+TAM、M2型巨噬细胞CD163的高表达可以预测CRC的不良预后。然而，也有完全不同的结果，TAM 通过 Fcγ 受体捕获抗 PD-1 抗体，限制了对肿瘤浸润性 CD8+T 细胞的可用性。除了 T 细胞之外，PD-1/PD-L1 的中和还可以直接影响巨噬细胞发挥作用，M2型表达不同的抑制性受体(例如，PD-1 和 Sirpα)，损害肿瘤细胞的摄取影响ICB 功效。在 CRC 患者中，ST2 在 TAM 中过度表达，ST2/IL-33 轴上调TAM 降低肿瘤内 CD8+T 细胞的频率和功能，这突出了增强 TAM 效应物在 CRC 免疫治疗中的潜力。CD47 由正常组织和造血细胞表达，Sirpα/CD47 轴阻断吞噬作用，防止自身组织被破坏[41]；
然而肿瘤中CD47 的上调代表了一种逃避免疫清除的机制，与CD44 表达和 EMT 相关，已有报道Sirpα/CD47 阻断剂和 ICB 的协同作用，但尚未在CRC中得到验证。巨噬细胞靶向方法与 ICB 的结合在不同的临床前模型中显示出有希望的结果，巨噬细胞的成功免疫疗法复杂，难以驾驭却值得尝试。

2.4 MDSC

异质的未成熟髓细胞群，由单核髓细胞和粒细胞组成，1980 年代初期被发现具有免疫抑制作用， 2007 年被统一命名为MDSCs。MDSCs 抑制 T 细胞和NK细胞抗肿瘤反应，促进肿瘤存活、血管生成和转移，因此成为潜在的治疗靶点。CRC等肿瘤组织富含 MDSC，与抗 PD-L1 治疗的疗效及肿瘤病理分期有关，并且可能是 MSI L患者对抗 PD-1 治疗耐药的重要因素，功能状态由 TME 调节，如受谷氨酸代谢影响。相关研究表明低比例的活化T细胞即能有效诱导MDSC凋亡[42]。

2.5 TAN

肿瘤细胞和 TAM 释放趋化因子 CXCL1/2/3/6/8 和 CCL3/5，诱导外周血中的中性粒细胞进入 TME 并极化成不同的 TAN，加尔迪罗等人发现接受 5-FU 化疗的 CRC 患者， TAN 浓度越高，治疗效果越好。贝瑞等人研究表明高水平的 TAN 与 II 期 CRC 患者更好的生存期相关。然而饶等人发现TAN的增加与恶性表型相关，高中性粒细胞与淋巴细胞比率 (NLR) 也已被证明是 CRC 患者的不良预后因素。TAN受到多种干预措施(包括 GM-CSF、VEGF 和趋化因子抑制)的调节，组织中的量化和定位仍然是一个挑战[43]。

2.6 DC

主要发挥抗呈递功能，也能表达PD-L1 和 CD80/86[44]，在适应性免疫的启动和调节中起核心作用，其功能受损是免疫逃逸的一种机制。IL-12 是一种由巨噬细胞和DC产生的促炎细胞因子，可促进 CD8+T 细胞和 NK 细胞的分化和活化。小鼠模型证明PD-1 阻断联合 IL-12 疗法在肺癌中具有协同抗肿瘤活性。

2.7 NK细胞

NK细胞对异常细胞具有自发的细胞毒性作用,浸润性 NK 细胞激活和抑制受体(例如杀伤细胞免疫球蛋白样受体)，与相关配体一起形成一个复杂NK 细胞调节网络，并因此提供了转化干预的潜力。许多检查点抑制剂疗法不仅影响效应 T 细胞，还影响 NK 细胞，CRC中的 NK 细胞活性有所下降，似乎与更差的临床结果有关。然而，它们与 T 细胞及免疫检查点的相互作用和预后意义尚不十分清楚。

2.8 成纤维细胞

除了结构作用外，成纤维细胞还具有炎症潜能及协调功能。目前的临床试验主要针对其破坏功能(如靶向成纤维细胞激活蛋白α)及调节功能，后者可以通过调节关键信号通路来实现，包括成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子或基质衍生因子 1α/CXCL12 的信号通路。常见关于抑制血管生成和基质调节的临床实验设计，如阿法替尼靶向基质隔室和基质形成。此外，调节癌症相关成纤维细胞中的 CXCL12轴将消除其抗迁移作用，募集T 细胞攻击肿瘤细胞。

表1 正在进行中的免疫联合治疗CRC临床试验总结

2.9 TGF-β 是一种由肿瘤和宿主免疫细胞产生的抗炎细胞因子，通过抑制 TCR 信号传导、T 细胞分化和上调 Tregs来促进免疫抑制轴。TME 内 TGF-β 信号通路基因的过度表达与一部分 CRC 患者的预后较差有关，抗 TGF-β 和抗 PD-L1 单克隆抗体的组合可增加 CD8+TIL 数量，诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。

人类微生物群由10～100万亿个微生物组成，包括细菌、病毒、原生动物和真菌，其中最大的微生物群居于肠道，具有 1.5 公斤的生物量，肠道细菌主要是厚壁菌门和拟杆菌门，其组成受年龄、饮食、环境、性别、种族以及微生物群落与其宿主之间的共同进化力量的影响。肠道微生物群作为一个独立的器官，在人类健康中起着至关重要的作用。宏基因组测序技术分析表明，正常肠道微生物群的生态失调可能是肥胖、糖尿病、炎症性肠病、肠易激综合征和许多类型的癌症，尤其是CRC的危险因素[46]。

1975 年首次报道了肠道微生物群与 CRC 的相关性，近年来发现一些肠道微生物可以诱导肠道免疫细胞分泌IL-23，促进肿瘤的发生和发展[47]。已经确定，CRC 患者与健康受试者具有不同的微生物群[48]，肿瘤组织和邻近黏膜的肠道微生物组成失调与肿瘤的特定病理特征相关。肠道微生物群的失调包括某些细菌种类的扩张和消耗。由于采样性质(粪便与黏膜组织)、疾病阶段或位置的差异， CRC微生物群的研究存在差异。具核梭杆菌是一种革兰氏阴性厌氧菌，是 CRC中最常见的肠道细菌，在 CRC中高水平代表CRC 的不良预后，另外在 CRC 患者的粪便样本中也发现了特定的肠道病毒特征，也与 CRC 患者的存活率降低有关。

ICBs 的治疗效果也会受到肠道微生物影响。肠道微生物群、结直肠癌的演变和对治疗的反应之间的相互作用是复杂的，与结肠炎症相关的特定微生物具有促癌作用比如脆弱拟杆菌。Routy 及其同事在NSCLC 和肾细胞癌观察到异常的微生物组成可能是导致患者对抗 PD-1 免疫治疗无反应的原因即ICB 耐药。宏基因组学已确定对 ICB 的临床反应与选择性细菌种类的相对丰度之间存在显着关联。此外，在转移性黑色素瘤中，免疫治疗应答者中的微生物群显示出丰富的长双歧杆菌、产气柯林氏菌和粪肠球菌，而无应答者中有大量的Ruminococcus obeum和Roseburia gutis。一些临床前证据指出肠道细菌与基于 CpG-寡脱氧核苷酸 (CpG-ODN) 的免疫治疗方法的功效之间存在关联，到目前为止，在微生物群对 CRC ICB 反应的影响在很大程度上仍未被探索。

结直肠癌免疫检查点抑制剂治疗仍然面临疗效不佳等情况，且现有治疗在MSS CRC中仍有很大改进及提升空间，未来的挑战在于寻找新的预测免疫检查点疗效的预测分子，实现个性化治疗方案，新版指南增加了ICI作为MSI-H/dMMR CRC 新辅助治疗单药方案，有关ICI相关的MSI-H结直肠癌术后标准辅助化疗三期临床研究正在积极开展中(NCT02912559、NCT03827044、NCT-03803553)。MSS CRC免疫治疗目前临床研究的重点在ICI的联合用药方面，目前常用的联合方式[50]包括免疫联合化疗、免疫联合MEK抑制剂、免疫联合酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、双免联合、免疫联合抗EGFR及免疫联合放疗,期待相关临床试验能带来喜人的结论，总之，提高ICI治疗在CRC中疗效的关键在于促进效应T淋巴细胞对肿瘤细胞的消灭，目前在T细胞方面的研究已相对完善，将来是否可以以B淋巴细胞入手，落脚于上述关键点来发展新的免疫策略，需要我们用实践来验证。