冠心病继发认知障碍的动物模型研究进展

王 青，刘凤岚，徐仕晗，刘艳飞，刘 玥，徐凤芹

1. 中国中医科学院西苑医院老年二科（北京 100091）

2. 中国中医科学院西苑医院国家中医心血管病临床医学研究中心（北京 100091）

3. 广东药科大学研究生院（广州 510006）

冠心病和认知障碍是老年人多发病、常见病，随着人口老龄化的加剧，其患病率呈持续增长趋势，对社会和公共卫生产生重大影响。认知功能障碍指患者的记忆、语言、视空间、执行、计算、理解判断等方面出现一项或多项受损。冠心病与认知障碍的发生密切相关[1]，冠心病患者认知损害或痴呆发生风险平均可增加45%[2]。Greaves等研究显示，约40%接受心脏搭桥手术的冠心病患者在术后1至5年内被诊断为认知障碍[3]。稳定性冠心病患者随访4年后，认知障碍发生率为42.4%[4]。

冠心病患者认知功能障碍发病机制可能类似于血管认知功能障碍，主要有脑小血管病[5]、动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）[6]、血小板高度激活[7]、慢性炎症[8]等假说。冠心病继发认知障碍的潜在生物学机制尚不清楚，而构建合适的动物模型是揭示其发病机制的基础。本文对当前各类冠心病继发认知障碍实验动物模型的制备方法、相关评判指标作一总结，以期为深入研究冠心病继发认知障碍发病机制和评价相关治疗药物的作用提供动物模型参考。

疾病动物模型可在病理学研究、发病机制探讨、药效学及生物标志物的验证等方面发挥作用[9]。冠心病常用的实验动物有大鼠、小鼠、兔、小型猪、豚鼠、犬等，认知损伤建模目前涉及的动物有大鼠、小鼠、沙土鼠、斑马鱼、果蝇以及羊类、犬类、灵长类动物（狒狒、食蟹猴、恒河猴）等[10]。在众多动物中，啮齿类动物最为常用，其具有与人类基因水平高度同源、免疫力及对外界环境的适应力强、存活率高、繁殖快、易获得等特点[11]，故被更多研究者所选用。鉴于此，目前在冠心病继发认知障碍的动物模型制备时，最常选用的实验动物是大鼠和小鼠。

应用大鼠进行冠脉疾病动物模型制备和研究的历史悠久，尤其是在建立心肌梗死模型方面，原因是大鼠冠脉系统稳定且侧支循环缺乏，发生心梗时心肌坏死出现早，且与人类临床心肌梗死和充血性心力衰竭的病理生理过程较为相似[12]。Wistar和SD大鼠是现今国内外应用最多的大鼠品系，其中Wistar大鼠被广泛应用于神经-内分泌实验研究；
SD 大鼠的神经系统与人类相似，常被用于如奖励惩罚实验、迷宫实验等反映高级神经功能和学习记忆的研究中[13]。临床上由心脑血管疾病引起慢性缺血性脑灌注不足所致血管性认知障碍动物模型的建立常用手术结扎或阻塞损伤脑部供血的主要血管制备，选择大鼠模型更易操作，且术后出现的认知功能障碍比小鼠更加明显[14]。同样，在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中也常用大鼠制备动物模型，此外，大鼠有更强的快速学习能力，能够更好地执行学习与认知研究相关任务，与人类疾病表现更为相似[15]。

小鼠与人类的血脂成分不同，具有心血管保护作用的高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-Ch）在其体内含量较高，而致冠状动脉粥样硬化作用的低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-Ch）含量偏低，因此不易形成AS斑块[16]。但随着基因敲除技术的发展，转基因小鼠模型被越来越多的研究者使用。如目前最常见的载脂蛋白E基因敲除小鼠（ApoE-/-小鼠），它是以近交系鼠C57BL/6小鼠为背景的基因敲除鼠，相较于普通小鼠，其发生AS、冠心病的可能性更高，经高脂喂养后更易成模[17]。载脂蛋白 E（ApoE）属于可交换载脂蛋白家族，具有基因多态性，可能通过调节脂质代谢和转运与冠心病相关，有研究表明携带APOEε4等位基因的急性冠脉综合征患者在出院后半年随访时有着较高的心血管终点事件发生率[18]。另外，APOE也是主观认知功能下降、轻度认知障碍和阿尔茨海默病的易感基因，携带APOEε4等位基因、主观认知下降的患者脑淀粉样变性病变患病率是非携带者的2～3倍[19]。Tam等研究了人类和APOE靶向替换转基因小鼠APOE基因与肠道微生物组成间的关系，研究发现通过调节肠道微生物群或许能够减轻APOEε4等位基因对认知功能下降的有害影响[20]。因此ApoE-/-小鼠不仅是目前冠心病、AS研究的经典模型，在认知功能障碍等神经退化性疾病领域中也有所应用。Goodarzi等对阿尔茨海默病再生医学动物模型的研究认为小鼠具有体积小、成本低、适合大样本研究的优势，并指出转基因小鼠模型有助于研究与阿尔茨海默病相关基因的功能机制[15]。

目前，对于冠心病动物模型的制备方法较为成熟，但冠心病继发认知障碍的制模方法仍在探索中，对现有相关模型的制备方法进行归纳梳理后发现多是在成功复制冠心病模型的基础上再进行认知功能的评价，现将常用模型制备方法介绍如下。

2.1 高脂饲料诱导模型

AS的发生发展与冠心病密切相关。有研究显示在AS状态下，体内存在微栓塞、脑心输出量减少、炎症因子释放等现象，它们可能与认知损伤有关[21]。通过高脂饲料诱导是目前复制冠状动脉粥样硬化实验动物模型的基础制备方法。高脂饲料通常是在常规饲料的基础上加入适量的胆固醇、猪油、豆油、蛋黄粉等，具体依据所选动物、造模方法及实验设计而定。研究表明单纯高脂饮食很难诱导出AS病变[17]，鉴于大鼠本身无胆囊且具有抗AS特性，故选用大鼠建模时，高脂饲料中需添加胆酸钠（促进胆固醇吸收）和丙基硫氧嘧啶（减少对胆固醇的代谢）[22]。

虽然高脂饲料诱导基本符合人类AS形成过程，但是其用时长，且难以造出晚期AS病变，因此更多以高脂喂养为基础，联合腹腔注射维生素D3、基因改造、冠脉结扎、机械损伤、免疫炎症诱导等方法构建冠心病动物模型[23]。有研究显示，给予Wistar大鼠腹腔注射维生素D3（2 mL/kg，连续3 d，分3次）后，联合高脂饲料喂养12周可成功建立冠状动脉粥样硬化大鼠模型[24]。因人类血管壁中钙含量与冠心病严重程度呈正相关，维生素D3可增加血钙浓度致使动脉血管壁被破坏，从而加速AS的发生[25]。卢令慧等研究采用左冠状动脉前降支结扎术结合高脂饮食喂养SD大鼠28 d，通过检测心电图、血脂水平、超声心动图等成功复制了冠心病气虚血瘀痰浊的病证结合动物模型，成模率为66.7%[26]。

2.2 转基因动物模型

目前大部分的转基因动物为不同品系小鼠，用其建模可以更好地理解疾病的生物学基本特性。ApoE-/-小鼠是冠心病基础研究中最为经典的一种转基因小鼠模型，由于其体内缺乏ApoE，导致LDL代谢障碍，使得血浆胆固醇浓度显著升高，是非基因敲除鼠的8倍之多[27]。人和小鼠ApoE的同源性达70%，即使是给予普通饮食也能诱发AS，并易致易损斑块形成，而高脂饮食可加速上述进程[28-29]。Li等对经高脂饲料喂养12周的ApoE-/-小鼠取头臂动脉和冠状动脉行病理检测发现管腔内均有斑块形成，血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、LDL-C水平显著升高，表明成功复制了冠心病模型[30]。microRNA的主要功能是通过与其mRNA识别序列结合来调节靶蛋白转录后表达，有报道称microRNA-1在心脏中过度表达可导致神经元微管损伤[31]。Duan等采用心脏特异性高表达的microRNA-1转基因小鼠进行实验，发现小鼠心脏和海马中的microRNA-1水平均升高，且伴随着突触小泡的重新分布和胞吐相关蛋白表达的降低[32]，这是对心血管疾病导致认知功能障碍在分子机制方面作出的探索。

2.3 冠状动脉结扎模型

目前经冠状动脉结扎法制作心肌缺血、心肌梗死模型已较为成熟[33]。通过结扎左冠状动脉前降支阻断冠脉供血，造成管腔狭窄或闭塞，进而致心肌缺血缺氧甚至坏死，该过程在血流动力学及心肌代谢方面的改变与临床上冠心病患者心肌缺血及心梗时的发病过程较为相似[34]。具体操作为：在呼吸机支持下将雄性成年SD大鼠麻醉后，于左侧第3、4胁间切口，打开胸腔并撕开心包，轻压两侧胸壁，将心脏挤出于胸腔外，用6-0号线于左心耳下2 mm处结扎左冠状动脉前降支，建立心肌梗死模型，造模成功率为83%，术后24 h存活率为77%[35]。结扎一段时间，使冠状动脉再通，即为心肌缺血再灌注模型。既往研究报道，C57BL/6J小鼠结扎左冠状动脉3个月后（成活率84%）出现了显著的认知障碍，并伴有β-淀粉样蛋白代谢、凋亡和炎症的改变，表明心肌梗死后痴呆的可能性增加[36]。

2.4 化学干预模型

冠脉供血不足会导致心肌缺血，是冠心病的主要病变基础，短暂缺血会引起心绞痛，严重缺血可致心肌梗死[37]。心肌功能受损可通过缺氧或代谢底物耗竭引起的改变对脑、肾、肝等其他灌流器官产生不良影响，认知功能减退是心脏功能受损引起神经元组织低灌流所致的主要临床表现之一[38]。异丙肾上腺素（isoprenaline，ISO）是一种人工合成的β受体激动剂，可引起心肌过强过快收缩，冠脉发生痉挛，增加心肌耗氧，出现心肌缺血、坏死等现象，可用于心肌缺血、药物性心肌损伤、心肌梗死等疾病的模拟，更符合临床冠心病的病理过程[39]。常用10～120 mg·kg-1·bw-1剂量的ISO连续两次或多次对啮齿类动物进行皮下注射制备心肌梗死模型[40]。据报道，给予Wistar或SD大鼠连续2 d（间隔24 h）皮下注射ISO 85 mg·kg-1·bw-1[41]或 100 mg·kg-1·bw-1[42]后，均可见心功能显著下降、血清心肌损伤标志物升高、心肌组织水肿伴炎症及坏死，表示成功构建了心肌梗死模型。有研究者通过对SD大鼠皮下注射 85 mg/kg ISO和慢性轻度应激刺激模拟了心肌梗死后抑郁状态的动物模型[43]。Tóth等利用ISO成功诱导了Wistar大鼠急性交感神经应激状态，并对大鼠的心脏损伤、神经炎症、脑功能和认知行为进行了观察与评估[44]。几种常用冠心病继发认知障碍动物模型的比较见表1。

表1 几种常用冠心病继发认知障碍动物模型的比较Table 1. Comparison of several commonly used animal models of cognitive impairment secondary to coronary heart disease

3.1 冠心病相关评估

对冠心病动物模型制备的评价方法已基本达成共识，如高脂饲料诱导所致的冠状动脉粥样硬化的评估主要集中在血脂水平和主动脉、心肌组织的病理染色上，也有对心肌损伤标志物及炎性因子的血清学检测。冠状动脉结扎法或ISO诱导法所致的心肌缺血、心肌梗死模型评价方法主要是心电图、定量组织学和血清酶学等综合指标的测定。

3.2 认知功能评估

目前对动物认知功能的评估多采用行为学评价方法，也有研究根据实验目的结合组织病理学、影像学等进行判断。有报道指出，目前探究动物行为学实验的方法以Morris水迷宫为主，Y迷宫、八臂迷宫、主动/被动回避、跳台实验等为辅，并且各种新型改良版放射迷宫也在不断出现，研究者可根据实验需要及实验动物进行合理选用[45]。

3.2.1 Morris水迷宫实验

Morris水迷宫是一种研究啮齿类动物空间学习和记忆能力的测试装置，目前被广泛用于学习记忆能力、认知障碍、衰老等方面的研究，主要包括定位航行实验和空间探索实验两部分[46]。

王玉选取8周龄ApoE-/-小鼠予高脂饲料喂养12周后，检测血脂发现TC、TG、LDL含量明显增加、HDL明显减少，HE染色示主动脉有明显的斑块形成，说明AS建模成功；
模型组小鼠的Morris水迷宫实验逃避潜伏期与游泳总路程明显增加、穿越平台次数显著减少，提示其出现认知功能障碍，且乙酰胆碱酯酶、β-淀粉样蛋白及相关炎性因子的表达显著增加，成功建立了因AS继发的轻度认知障碍小鼠模型[47]。Ravindran等以ISO溶液80 mg/kg连续两次对Wistar大鼠行皮下注射，给药第2 d见心电图ST段抬高，血浆中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）和缺血修饰白蛋白（IMA）水平显著升高，第8 d取心组织行心梗面积测定及HE染色观察发现肌原纤维排列严重紊乱、中性粒细胞大量浸润，并伴有水肿，说明心肌梗死建模成功；
在此期间采用Morris水迷宫和放射臂迷宫测试评估ISO诱导的心肌损伤对大鼠学习和记忆能力的影响，结果显示与假手术组相比，模型组大鼠需要更多的时间到达平台且参考记忆错误数量显著增加，表明模型小鼠学习和记忆能力逐渐下降，建立了心梗后的认知障碍大鼠模型[48]。

3.2.2 Y迷宫实验

Y迷宫主要是利用啮齿类动物对新环境探索的天性来实施，以测定它们的空间工作记忆能力，被广泛用于认知功能减退、趋向性、空间学习记忆等领域[49]。

有研究对SD大鼠连续高脂饲料喂养10周，期间分3次给予维生素D3腹腔注射（第1周60万 IU/kg、第3周10万 IU/kg、第6周10万IU/kg），第10周末取材检测发现大鼠血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL升高，油红O和HE染色可见斑块形成、主动脉管壁增厚、平滑肌细胞排列紊乱、数量增加，说明AS造模成功；
持续4周的有氧运动干预后行Y迷宫实验，结果显示模型组大鼠空间识别能力和工作记忆能力受损，与对照组相比，在空间识别实验中进入新异臂次数减少、停留时间缩短，同时取脑海马组织检测显示海马代谢异常以及突触可塑蛋白表达受损[50]。Koji Ito等通过对10周龄的ICR小鼠行左冠状动脉结扎制备心肌梗死模型，术后1周和4周行超声心动图示心肌梗死组小鼠的左心室内径明显小于假手术组，并通过行Y迷宫测试评价其认知功能，发现心肌梗死组小鼠的自发交替次数显著低于假手术组小鼠，表明心肌梗死模型小鼠的空间工作记忆能力下降，出现认知障碍，并且下丘脑和海马区的脑Sigma-1受体（S1R）表达降低，而S1R的减少在精神障碍的发病机制中起重要作用[51]。

3.2.3 主动/被动回避实验

回避实验是利用动物的喜暗恶光（明暗穿梭）、对厌恶刺激（如足电击）的恐惧和记忆而建立起来的，用来评估啮齿类动物的空间学习记忆能力，主要是反应皮质功能[52]。主动位置回避是指动物在一个缓慢旋转的圆形舞台中有某一固定的电击区域，若动物进入该区域则会受到轻微电击，动物通过学习避免进入该区域，研究者通过对电击次数、回避所需时间及运动路径等数据进行记录以评估认知功能情况[53]。被动回避测试中的避光实验是利用啮齿类动物喜暗特性，实验时将动物放入一个由明、暗两室组成的装置中，当其由明室进入暗室时即会遭受一次电刺激令其返回明处，从而获得记忆的训练，之后间隔24或48 h记录动物从明室进入暗室的间隔时间（即潜伏期）和电击次数，潜伏期越长、受电击次数越少表示学习和记忆力越好[54]。

有研究为了探究心肌梗死与认知功能减退及血管性痴呆的关系，对5～6月龄的雄性C57BL/6小鼠进行左冠状动脉结扎成功建立心肌梗死小鼠模型，4周后通过主/被动回避实验对小鼠进行学习和记忆能力评估，结果发现与假手术组相比，心肌梗死小鼠的被动回避潜伏期显著减少，主动回避潜伏期增加，说明心肌梗死后C57BL/6小鼠的记忆明显受损、认知功能减退[55]。

3.2.4 新物体识别实验

新物体识别实验是根据动物对熟悉物体和新异物体探索时间的长短来检测其识别记忆能力的方法。实验主要分为适应期、 熟悉期和测试期三个阶段。适应期时将动物放入没有任何物体的实验装置中，使其自由探索并适应实验环境；
熟悉期是将两个完全相同的物体放入，记录动物与其接触的情况；
测试期是将其中一个熟悉物体换成新物体，观察并记录动物对它们的探索时间，把探索新物体和熟悉物体所用的时间分别记为TN和TF，并计算识别指数（recognition index，RI），即RI= TN/（TN+TF）×100%，最后通过上述指标评估动物的认知记忆能力[56]，当被测试动物未遗忘环境中见过的熟悉物体，便会用更多的时间探究未见过的新物体，在熟悉物体上的探索时间就越短。

Hovens等用冠脉前降支结扎法制备心肌缺血再灌注模型，术后2周（成活率72%）对Wistar大鼠进行认知行为测试，新物体识别实验及Morris水迷宫实验皆表明大鼠的空间记忆、学习能力下降[57]。

3.2.5 其它评估方法

认知障碍的病因相当复杂，其涵盖了认知功能下降、轻度认知功能障碍到痴呆的整个疾病过程，在动物模型的评价上，除上述认知行为学的测评外，部分病理学及影像学的改变亦可作为提示。阿尔茨海默病的病理表现主要有细胞外淀粉样蛋白沉积、神经纤维缠结以及神经元数目减少等[58]。Bereczki等实验研究显示ApoB-100转基因小鼠在高脂饮食喂养18周后主动脉血流量减少了25%，并在其海马、大脑皮层和下丘脑中发现了广泛的神经元死亡和淀粉样斑块，磁共振成像显示小鼠第三脑室和侧脑室增大，提示ApoB-100的过表达与神经退行性病变有关[59]。Yuan等制备SD大鼠急性心肌缺血再灌注模型，术后3 d HE病理染色可见大鼠海马CA1区神经元损伤严重、排列紊乱，表明神经细胞凋亡，免疫组化示小胶质细胞活化，八臂迷宫实验示工作记忆错误次数增加，说明心肌缺血再灌注大鼠存在认知功能障碍[60]。

目前冠心病的模型制备方法较为成熟，如AS、心肌缺血、心肌梗死等疾病状态的动物模型制备均有多种方法可供选择，但检索文献并归纳整理后发现冠心病继发认知障碍的动物模型尚无稳定或较为公认的制备方法。如今常用的构建方法是首先按照常用的、可靠的模型建立方法成功制作出冠心病的动物模型，然后通过啮齿类动物行为学检测方法筛选出所需的认知障碍模型，但这可能存在成功率偏低、评估方法不统一的问题。

在实验动物的选择上，从冠心病和认知障碍疾病领域来看，虽然非人灵长类动物是理想的动物来源，但是由于价格高昂、获取来源不便、实验条件较高，在实际操作中可行性并不高；
而啮齿类动物因其操作方便、来源可靠、可大规模复制，故被广泛使用。在模型的制备上多根据研究目的及研究疾病的病理特征来选用，如由心肌梗死引起的认知障碍中，用冠状动脉结扎法在大鼠上建立模型已较为成熟，且可供使用的评估方法可行性强。

需要指出的是，目前对认知障碍的评判方法还多集中在动物行为学的测评方面，因此存在一定的局限性。因人类的认知功能本就复杂，单纯的行为学测试不足以完全表达，必要时应结合先进的神经电生理技术、影像学、组织病理学等方法综合评估。此外，由于研究者关注的重点是冠心病继发认知障碍，因此并不能使用冠心病模型叠加认知障碍模型，即所谓的复合模型，这种先制备出冠心病模型，再用其他措施诱导出认知障碍的方法不符合研究目的，也无法展示疾病本身的病理过程。理想的动物模型应是与临床发病机制切合，且来源易获取、可操作性强、成本适宜的。因此探索开发稳定可靠、重复性好、成模率高的冠心病继发认知障碍的动物实验模型对该病的研究具有重要的意义。未来应加强基于临床特征的并病动物模型的研发，对于新药研发及深入认识疾病的病理生理机制非常重要。