辛伐他汀通过抑制calpain活性减轻ApoE基因敲除小鼠肝功能损伤

杨雅迪，陈锦华，唐富天

(1.锦州医科大学药理教研室，辽宁 锦州 121000；
2.铁岭卫生职业学院，辽宁 铁岭 112008；
3.兰州大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；
4.兰州大学第二医院心内科、甘肃省消化系肿瘤重点实验室，甘肃 兰州 730030)

辛伐他汀(simvastatin，Sim)为羟甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂类降脂药[13]，通过降血脂作用发挥对心血管疾病的保护作用。然而，研究发现在低于降脂作用的剂量下，Sim仍然对心血管、脂肪肝等疾病具有保护作用[14-15]，然而其作用机制还不十分清楚。本实验将利用高脂饲料喂养的载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E knockout，ApoE KO)小鼠作为NAFLD模型，研究Sim对小鼠肝功能障碍的保护作用，同时观察Calpain特异性抑制剂PD150606(PD)对肝功能的影响，并从氧化应激、炎症反应和calpain活化等方面探讨其作用机制。

1.1 材料

1.1.1动物 8周龄健康♂ApoE KO和C57小鼠，体质量(20±2) g，由南京模式动物中心提供。实验动物在给药前适应性饲养2周。

1.1.2试剂 高脂饲料购自北京博泰宏达生物技术有限公司。Sim购自上海默克公司。从南京建成生物工程研究所购买如下试剂盒：总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)含量测定试剂盒，天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和谷氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性测定试剂盒，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性测定试剂盒，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)含量测定试剂盒。PD150606和活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量测定试剂购自Invitrogen公司。

1.1.3仪器 Elx-800型酶标仪购自Bio-tek公司，紫外分光光度计购自购自Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1动物分组及干预 10只C57小鼠作为对照组(C57组)，30只8周龄雄性ApoE KO小鼠随机分为3组，每组10只即ApoE KO组，ApoE KO+Sim(5 mg·kg-1，p.o.)组，ApoE KO+PD(5 mg·kg-1，i.p.)组。每天1次，给药干预时间为12周，并且均采用高脂饲料喂养。Sim以0.5%羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)制成混悬液，灌胃剂量为10 mL·kg-1。PD以0.1% DMSO溶解，注射剂量为10 mL·kg-1。Sim和PD的剂量选择是基于我们之前发表的文章确定的[16-17]。

为保证模拟结果的可靠性，对光滑管从0.5～2.0m/s的入口流速进行模拟，由于研究流体为无相变流体在光滑管管内作强制流动，可将模拟得到的摩擦系数fA与Blasius公式计算理论值对比[9]，从而判定模拟结果的可靠性。结果如表2所示。

1.2.2血清和肝脏中脂质含量测定 将血样和肝脏匀浆3 000 r·min-1离心10 min，留取上清，使用南京建成生物工程公司试剂盒测定其TC和TG含量。采用酶法生成的反应物在490 nm处测定吸光度。

1.2.3MDA含量和SOD活性测定 肝脏中MDA含量和SOD活性测定采用南京建成生物工程公司试剂盒进行。MDA含量的测定原理和方法为：过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰。SOD活性的测定原理和方法为：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计于550 nm处测其吸光度并计算活性。

1.2.4血清AST和ALT活性测定 应用南京建成生物工程公司试剂盒测定血清AST和ALT活性。AST的测定原理和方法为：AST能使α-酮戊二酸和天门冬氨酸移换氨基和酮基，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反应过程中可自行脱羧成丙酮酸。丙酮酸与2，4二硝基苯肼反应生成2，4二硝基苯腙，在碱性溶液中显红棕色。用可见光分光光度计于510 nm处测其吸光度并计算活性。ALT的测定原理和方法为：ALT作用于丙氨酸及α-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸，加入2，4-二硝基苯肼盐酸溶液中止反应后，于505nm处测其吸光度并计算活性。

1.2.5IL-6和TNF-α含量测定 应用南京建成生物工程公司试剂盒测定肝脏中IL-6和TNF-α含量。测定原理和方法为：采用ELISA方法，反应物于450 nm处测其吸光度。

1.2.6DHE染色法测定肝脏组织中ROS含量 肝脏组织用冰冻切片机切片后加入DHE溶液(避光)，恒温水浴反应30 min后(避光)，用荧光显微镜采集图片，采用红色荧光的强度来判断细胞内ROS含量。

1.2.7Calpain活性检测 肝脏组织进行匀浆后，离心取上清，根据试剂盒说明书检测calpain活性。激发波长为380 nm，发射波长为460 nm。

2.1 Sim和PD对小鼠血清AST和ALT活性的影响与C57小鼠相比，ApoE KO小鼠血清AST(Fig 1A)和ALT(Fig 1B)活性分别增加了87.0%和85.2%。与ApoE KO小鼠相比，给予Sim和PD的小鼠血清AST活性分别降低了37.4%和48.8%，ALT活性分别降低了31.9%和38.7%，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明，Sim和PD对肝脏功能损伤具有保护作用。

2.2 Sim和PD对小鼠体质量、血清和肝脏脂质含量的影响各组小鼠体质量在实验前(Fig 2A)和实验后(Fig 2B)没有显著性差别。与C57小鼠相比，ApoE KO小鼠血清TC(Fig 2C)和TG(Fig 2D)分别增加了2.5倍和1.4倍，表明ApoE KO小鼠形成了明显的高脂血症。与ApoE KO小鼠相比，Sim和PD对小鼠血清TC和TG含量没有明显影响。另外，与C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝脏TC(Fig 2E)和TG(Fig 2F)含量分别增加了1.2和1.0倍，表明ApoE KO小鼠形成了明显的脂肪肝。与ApoE KO小鼠相比，给予Sim和PD的小鼠肝脏TC和TG含量没有明显的变化。上述结果表明，Sim和PD对肝脏损伤的保护作用与血脂和肝脏脂质含量无关。

Fig 1 Effect of Sim and PD on AST (A) and ALT (B) activity in serum**P<0.01 vs C57 group;##P<0.01 vs ApoE KO group.

Fig 2 Effect of Sim and PD on weight (A and B)，serum TC (C) and TG (D) contents，liver TC (E) and TG (F) content1:C57；
2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01 vs C57 group

Fig 3 Effect of Sim and PD on MDA (A) content and SOD activity (B) and ROS content (C) in liver
1:C57；
2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01vsC57 group;##P<0.01vsApoE KO group.

2.3 Sim和PD对小鼠肝脏MDA含量、SOD活性和ROS的影响与C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝脏MDA(Fig 3A)含量增加了1.5倍，而SOD活性(Fig 3B)降低了63.0%。与ApoE KO小鼠相比，给予Sim和PD的小鼠肝脏MDA含量分别降低了33.5%和43.1%，而SOD活性分别增加了62.1%和112.7%，差异具有统计学意义。另外，与C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝脏ROS(Fig 3C，3D)含量增加了5.4倍。与ApoE KO小鼠相比，给予Sim和PD的小鼠肝脏ROS含量分别降低了50.0%和51.8%，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果表明，Sim和PD降低肝脏氧化水平，增加肝脏抗氧化能力可能是保护肝脏功能的一个重要机制。

2.4 Sim和PD对小鼠肝脏TNF-α和IL-6含量的影响与C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝脏TNF-α(Fig 4A)和IL-6(Fig 4B)含量分别增加了2.0倍和2.2倍。与ApoE KO小鼠相比，给予Sim和PD的小鼠肝脏TNF-α含量分别减少了35.1%和42.8%，IL-6含量分别减少了29.9%和32.7%，差异具有统计学意义。结果表明，抗炎作用是Sim和PD保护肝脏功能的另一个重要机制。

Fig 4 Effect of Sim and PD on TNF-α (A) and IL-6 (B) in liver1:C57；
2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01 vs C57 group;##P<0.01 vs ApoE KO group.

2.5 Sim和PD对小鼠肝脏Calpain活性的影响与C57小鼠相比，ApoE KO小鼠肝脏中calpain活性增加了3.9倍(Fig 5)。与ApoE KO小鼠相比，给予Sim和PD的小鼠肝脏calpain活性分别降低了47.1%和63.1%，差异具有统计学意义。结果表明，Sim和PD降低calpain活性可能是保护肝脏功能的重要机制。

Fig 5 Effect of Sim and PD on calpain activity in liver1:C57；
2：ApoE KO;3:ApoE KO+Sim;4:ApoE KO+PD.**P<0.01 vs C57 group;##P<0.01 vs ApoE KO group.

本研究结果显示，Sim能够减轻脂肪肝所致的肝功能损伤，但对血清和肝脏脂质含量没有明显影响。Sim还能够降低肝脏MDA和ROS含量、提高SOD活性，降低肝脏TNF-α和IL-6水平以及calpain活性。研究还发现，calpain抑制剂PD和Sim有相似的作用。这一发现揭示了Sim保护肝功能损伤的新机制。

血清AST和ALT活性是反映肝脏功能的重要指标。本研究发现，Sim能够明显降低ApoE KO小鼠血清AST和ALT活性，表明Sim对脂肪肝诱导的肝脏功能损伤有明显的保护作用。有研究发现[14-15]，Sim对醋氨酚和胆汁淤积性小鼠肝损伤也有明显的保护作用。上述研究结果表明，Sim对多种因素造成的肝功能损伤有保护作用，然而其保护作用机制还不十分清楚。

研究发现[18]，20%～80%的NAFLD患者伴有高脂血症，表明高脂血症是NAFLD的重要危险因素，而通过调节高脂血症就能够有效抑制NAFLD。然而，本研究结果表明，Sim对小鼠血清和肝脏中TC和TG含量没有明显的影响，说明Sim对肝脏损伤的保护作用并不是通过降低脂质含量实现的，而是存在其他的作用机制。我们之前研究发现[16]，Sim在对血脂水平没有影响的剂量下，能够明显抑制ApoE KO小鼠动脉粥样硬化，其机制与调节calpain-1表达、抑制氧化应激和炎症反应有关。为此，我们进一步探讨了这些机制在Sim保护肝功能损伤中的意义。

氧化应激与肝功能损伤关系密切，MDA水平是反映肝脏脂质氧化的重要指标，SOD是重要的抗氧化酶[14]。肝脏SOD活性下降导致ROS增加。本研究发现[7，15]，Sim能够降低ApoE KO小鼠肝脏MDA和ROS含量，升高SOD活性，表明降低肝脏氧化水平，增加抗氧化能力是Sim保护肝脏功能的重要机制。另外，炎症反应在肝脏功能紊乱中也具有重要作用，TNF-α和IL-6是重要的炎性因子。本研究发现，Sim能够减少ApoE KO小鼠肝脏TNF-α和IL-6含量，表明抗炎作用与Sim保护肝脏功能密切相关。有临床研究报到，TNF-α和IL-6可能参与促进肝脏损伤和NAFLD发展[7]。除了抗氧化应激和炎症反应的作用外[16-17]，Sim还能够抑制醋氨酚诱导的小鼠肝损伤的细胞凋亡[14]。

Calpain活化在肝功能损伤中具有重要意义[11-12]。我们前期研究发现，calpain-1基因敲除通过抑制氧化应激和炎症保护高脂饮食诱导的小鼠肝功能障碍[12]。本研究发现，Sim能够降低ApoE KO小鼠肝脏中calpain活性，说明抑制calpain活性与Sim降低氧化应激和炎症水平，进而改善肝功能有关。为了进一步验证抑制calpain活性和上述作用的关系，本研究还发现，calpain特异性抑制剂PD在抑制ApoE KO小鼠肝脏中calpain活性的同时，还能够降低氧化应激和炎症水平，进而改善肝功能。和Sim作用一致，PD对血脂和肝脏脂质水平也没有明显的影响，其肝功能保护作用与降低氧化应激反应和炎症水平有关。

总之，该研究表明Sim和PD都能够改善ApoE KO小鼠肝功能损伤，其机制可能与抑制calpain活性，进而提高机体抗氧化能力，降低炎症反应有关。