高雄激素调控颗粒细胞系全基因组靶基因及通路的初步探讨*

魏友华，马兆文，仇雪梅，赵淑芹*

(山东省枣庄市妇幼保健院 a.医学遗传与产前筛查科;b.生殖遗传中心,枣庄 277000)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种较常见的女性内分泌性疾病，发病率约占育龄女性的5%～10%，是无排卵性不育的主要病因。PCOS的基本特征是长期不排卵或稀发排卵、高胰岛素血症、卵巢多囊样改变、高雄激素血症以及女性生育力降低。目前PCOS的发生机制并不十分明确，不少研究表明雄激素过多可能是导致PCOS的根本原因之一[1]。已有研究发现了众多的PCOS相关差异表达基因[2]，但高雄激素发挥作用的直接效应基因或PCOS发病机制的关键基因以及雄激素通过何种机制调控相关基因的表达，目前尚不清楚。雄激素的功能发挥需与雄激素受体(androgen receptor,AR)结合。雄激素受体是一种转录因子，能识别靶因子上专一的DNA序列并与之结合，从而调控该基因的转录。PCOS患者卵泡发育障碍，卵子的发生是通过卵母细胞与其所处的卵泡微环境之间相互作用而获得。卵泡液中多种细胞因子及激素的产生主要依赖于卵巢颗粒细胞，其在卵子发生过程中起着重要作用。卵巢颗粒细胞的任何异常变化均可能导致PCOS患者卵泡发育异常，引起“多囊卵巢”的表现。多项研究认为，PCOS患者在高雄激素血症作用下颗粒细胞凋亡异常增加[3-4]。本研究以颗粒细胞系为研究对象，从雄激素受体作为转录因子的生物学属性的角度出发，首次通过染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)联合高通量测序技术(ChIP-Seq)的方法研究雄激素通过其受体可能结合的基因及信号通路，有助于从源头上揭示雄激素参与PCOS发病机理的机制，并提供潜在的治疗靶点。

1.1 细胞系 人卵巢颗粒细胞系KGN细胞用DMEM/F 12培养液(美国Gibco公司)培养，培养液中常规加10%胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL，置37℃、5% CO2、95%湿度下培养。

1.2 药物处理 本课题组前期研究应用不同浓度梯度的睾酮(0、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)处理KGN细胞，结果表明，高浓度睾酮(10-5mol/L)处理后，颗粒细胞凋亡显著增加。故本研究采用10-5mol/L睾酮浓度模拟高雄激素的作用。KGN细胞在37℃、5% CO2、95%湿度下培养于DMEM/F 12培养液，细胞培养至30%～50%汇合率时，分别应用溶剂(二甲基亚砜，对照组)或高浓度睾酮(10-5mol/L)处理48h，收集细胞用于后续的染色质免疫共沉淀分析。睾酮、二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品。

1.3 染色质免疫共沉淀 用1%甲醛处理细胞，使DNA-蛋白质的相互结合作用被交联固定，裂解细胞，得到全细胞裂解液，超声处理，将基因组DNA打断至100～500bp碎片，打断后的样品进行琼脂糖凝胶电泳。细胞裂解液中加雄激素受体AR的抗体(PG21,06-680,Sigma EMD Millipore,Darmstadt,Germany)和beads，4℃孵育。洗脱，并解交联，经交联反转和蛋白酶K处理，DNA被沉淀提取出，再准备构建DNA文库。

1.4 高通量测序及生物信息学分析 文库测序及质控按Illumina标准流程操作。使用Illumina样品准备包对DNA片段进行处理，包括末端修复、添加接头和片段大小选择，构建DNA文库(VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina,V2ND606-01)，进行高通量测序及数据的读取(Illumina HiSeq PE150)。高通量测序及数据分析由武汉爱基百客生物科技有限公司完成。

信息分析主要分为5部分：第一部分，数据预处理。去接头序列、污染序列、低质量碱基，获得可用于分析的序列(clean data)，并进行相关数据统计。第二部分，clean data定位到参考基因组，得到后缀名为bam文件，去除重复序列，保留唯一比对的序列(Unique Mapped Reads)。第三部分，将bam文件进行Peak检测，得到富集区域的信息。通过统计比对信息得到正负链间的链互相关系数(Strand Cross Correlation，SCC)以评估富集效果。链互相关系数通过最大交叉相关值除以背景交叉相关的比率(normalized strand cross-correlation coefficient,NSC)和片段长度相关值减去背景相关值除以幻影峰(phantom-peak)相关值减去背景相关值的比率(relative strand cross-correlation coefficien,RSC)衡量。当NSC显著小于1.05时，表示数据倾向于具有低信噪比，或者最后得到的Peak数很少(这可能与样本相关，如某些特定组织类型转录因子结合较少；
也可能是测序质量很差)。当RSC显著低于1时，实验往往具有低信噪比。RSC值较低可能是由于ChIP失败和质量差，测序reads质量低并且大量错配，测序深度低(显著低于饱和度)或这些原因共同导致。并进行Peak在基因功能元件的分布，最近基因寻找。第四部分，通过比对分析IP和input组的reads信息，得到质量合格的有效read序列。得到比对到基因组的有效reads的信息，利用MACS分析软件(version:2.1.1.20160309)在基因组范围内分析Peak信息。筛选显著性的Peak的阈值为Qvalue<0.05。第五部分，对实验组和对照组样本差异分析，统计差异Peak分布情况，从显著性差异Peak结果，找到距离Peak的summit位置(无summit位置则取中点位置)最近的转录起始位点对应的基因，即认为此Peak与该基因具有相互关联的特性。对这些基因进行KEGG注释，将KEGG注释的map号对应的gene进行富集分析，按P<0.05筛选出显著性富集的通路。

2.1 染色质免疫共沉淀DNA制备效果 片断化前DNA完整度较好，片断化后DNA片段弥散范围为100～2000bp，并且100～500bp之间的亮度最高，符合后续分析要求。见图1。

图1 各组样品DNA完整性及片段化效果的琼脂糖凝胶电泳图1：KGN应用溶剂处理组(KGN-NC，对照组)片段化前染色质；
2：KGN应用溶剂处理组(KGN-NC，对照组)片段化后染色质；
3：KGN应用10-5mol/L睾酮处理组(KGN-T，实验组)片段化前染色质；
4：KGN应用10-5mol/L睾酮处理组(KGN-T，实验组)片段化后染色质

2.2 高通量测序数据基本信息统计及质量评估 测序完成后，对原始数据进行去接头序列、污染序列、低质量碱基处理，获得高质量的数据(clean reads)进行数据统计，得到数据基本信息(表1)。从Q20和Q30可以看出测序质量可靠。实验组和对照组均对IP样本和Input样本同时进行测序，通过比对分析得到IP的有效reads。

表1 clean data数据统计表

2.3 高通量测序数据与参考基因组序列比对分析 将Clean reads数据使用BWA软件(version:0.7.15-r1140)比对参考基因组(参考基因组版本：Hgl9)(表2)，其中比对到基因组上唯一位置的reads(唯一比对reads)将用于后续的信息分析(表2)。

表2 ChIP-Seq序列比对结果统计

2.4 富集实验链互相关系数分析 通过链互相关系数评估富集效果。各组样本的NSC和RSC值见表3，各组NSC值均大于1.05，RSC值均大于1.0，提示雄激素受体抗体成功富集了其结合的DNA片段。

表3 样本链互相关系数统计表

2.5 全基因组Peak扫描及分布分析 采用Peak交集的方式对两个样品即对照组和高浓度睾酮处理组进行差异分析，确定组间上调及下调差异修饰的区间。高浓度睾酮处理后KGN细胞(KGN-T)中雄激素受体结合的Peak为1823个，对照组细胞(KGN-NC)中雄激素受体结合的Peak为2322个，两组均存在结合的Peak数为11个。

Peak在整个基因组范围内的分布：基因间区占0.4872，基因内含子区占0.4716，基因启动子区占0.0182，基因外显子区占0.0172，基因3"UTR区占0.0057。Peak在基因内的分布：基因内含子区占0.9197，基因启动子区占0.0356，基因外显子区占0.0335，基因3"UTR区占0.0112。可见大部分峰集中于基因间区与内含子。

2.6 高雄激素效应Peak关联基因KEGG通路富集分析 高雄激素诱导雄激素受体结合的Peak关联靶基因分别富集到凋亡、铁死亡、细胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAMs)、磷脂酶D信号途径、cAMP信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、磷酸肌醇代谢、神经活性配体-受体相互作用8个通路上，共涉及基因43个。富集通路及相关基因信息,见表4。

表4 高雄激素诱导其受体结合Peak关联靶基因KEGG通路富集分析结果

临床调查显示，60%～80%的PCOS患者出现血循环中高水平的睾酮，25%的患者出现血循环中高水平的DHEA[5]。这些数据均提示高雄激素可能是PCOS致病的根本因素。在动物模型中已证实，胎儿时期雄激素暴露会导致PCOS，但具体分子机制尚不清楚。

雄激素功能的发挥依赖于与雄激素受体结合。雄激素受体是一种转录因子，能识别靶因子上专一的DNA序列并与之结合，从而调控该基因的转录。在全基因组水平将转录因子定位于靶基因DNA是认识转录调控网络的有效方法。染色质免疫共沉淀联合高通量基因测序技术(ChIP-Seq)是研究转录因子结合位点、组蛋白特异性修饰位点、核小体定位及DNA甲基化等蛋白质与DNA相互作用的表观遗传学的关键技术之一。与ChIP-芯片相比，ChIP-Seq技术需要更少的标本量即可实现更高水平的单碱基对分辨率，同时具备更少的假阳性信号干扰和更好的覆盖范围和更大的动态范围，产生更精确的蛋白质结合位点列表，以及转录因子、增强子和序列基序的鉴定[6-7]。本研究以卵巢内分泌原理的两细胞理论学说为基础，选择卵泡颗粒细胞系为研究对象，首次应用ChIP-seq技术对高雄激素状态下导致的AR所介导的全基因组范围内基因表达及信号通路的改变进行系统分析，寻找颗粒细胞系中的关键AR靶基因对了解PCOS发生有着重要意义。结果表明，与未用睾酮处理组相比，高雄激素诱导雄激素受体结合的Peak关联靶基因富集到细胞凋亡、铁死亡、CAMs、磷脂酶D信号途径、cAMP信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、磷酸肌醇代谢、神经活性配体-受体相互作用8个信号通路上，共涉及基因43个。

高雄激素诱导雄激素受体结合的Peak关联靶基因富集到细胞凋亡信号通路。这与以往研究相符，已有多项研究认为PCOS卵泡发育障碍可能与高雄激素血症作用下颗粒细胞凋亡异常有关[3-4]。Ding等[3]对77例PCOS患者和67例健康人的外周血单核细胞进行研究，发现PCOS患者中凋亡相关基因PDCD4表达显著增加，卵巢颗粒细胞凋亡水平增加，而体外敲除PDCD4基因后能改善其凋亡水平。此外，本课题组前期研究结果表明，高浓度睾酮通过降低PDCD4启动子区的甲基化水平诱导卵巢颗粒细胞PDCD4表达上调，并促进其凋亡[4]。

研究发现，高雄激素诱导其受体结合基因富集到铁死亡信号通路。铁死亡是近年来新发现的细胞死亡类型，是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，由过度的脂质过氧化所引起，与各种类型肿瘤的发生和治疗反应有关。目前铁死亡在PCOS中的作用研究较少，母体高雄激素血症和胰岛素抵抗导致大鼠妊娠子宫和胎盘铁死亡的激活[8]。高雄激素对颗粒细胞铁死亡的影响，尚未见研究报道。

高雄激素诱导雄激素受体结合的Peak关联靶基因富集到的磷脂酶D信号途径、cAMP信号通路、磷脂酰肌醇信号通路多是涉及将胞外信号转换为胞内信号，通过第二信使及蛋白激酶的激活，对其一系列靶蛋白进行磷酸化，进而发挥生物学效应，参与细胞的众多功能改变。而神经活性配体受体相互作用信号通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体的集合。已有研究报道，PCOS的发病相关基因富集在神经活性配体受体相互作用、cAMP信号通路等方面[9]。此外，通过整合DNA甲基化和转录组分析来鉴定与PCOS相关的潜在重要生物标志物的研究也表明，PCOS与神经活性配体-受体相互作用信号通路具有相关性[10]。PCOS患者肌醇代谢异常[11]，可能存在肌醇转化为D-手性肌醇的缺陷，这种缺陷将导致胰岛素抵抗和高雄激素血症的综合征[12]。然而这些相关通路是否与高雄激素有关及其如何参与PCOS的发病机理仍需进一步研究。

高雄激素诱导雄激素受体结合的43个Peak关联靶基因中，已有研究报道CTLA4基因可能与PCOS相关，通过调节肥胖和HOMA-IR对PCOS产生影响[13]。F2R基因与PCOS具有相关性[14]。PIK3R1基因多态性与PCOS的主要表型无关[15]，循环ghrelin水平与PCOS的异常激素模式之间没有关系[16]。脱氢表雄酮建立的大鼠PCOS模型中p-JNK表达水平明显高于对照组[17]，JNK抑制剂具有预防PCOS的作用[18]。其他基因与PCOS的关系尚未见研究报道。高雄激素是否诱导其受体与这些候选基因结合尚需进一步研究证实。

综上所述，本研究发现了高雄激素诱导的卵巢颗粒细胞发生改变的重要信号通路，研究结果有助于从源头上揭示雄激素参与PCOS发病机理的机制，为PCOS的发病和遗传学机制提供新的思路。雄激素通过其受体可能结合基因的阐明为后续更深入地研究PCOS的发病机理奠定了基础。期待下一步的实验能筛选及鉴定出某些关键的雄激素受体直接作用的下游靶基因，为PCOS的治疗提供新靶点。