LC-MS/MS,法测定抗栓胶囊中蟾酥的两种成分含量*

程 妍，承 晨，薛 平

常州市食品药品纤维质量监督检验中心，常州 213000

抗栓胶囊是由当归尾、壁虎、水蛭、马钱子、甘草、骨碎朴、穿山甲、丹参、土鳖虫、蜂房、人工麝香、土茯苓、乌梢蛇、僵蚕、蜈蚣、地龙、蟾酥、延胡索、虻虫等19 味中药组成，可活血化瘀，抗栓通脉。用于治疗血栓闭塞性脉管炎瘀血阻络症，对脑血栓、心肌梗塞、血栓性静脉炎等亦有较好的辅助治疗作用。

目前，抗栓胶囊主要的质量控制在于显微鉴别方面[1，2]，包括僵蚕、土鳖虫、蜈蚣、虻虫、穿山甲、延胡索和甘草；
薄层鉴别方面[3，4]，包括丹参、甘草、当归尾、马钱子、土茯苓和骨碎朴；
液相色谱鉴别方面，主要为蟾酥。液相色谱检查方面，主要为马钱子[5]。液相色谱含量测定为丹参和蟾酥[6]。

蟾酥作为处方中的有效及有毒中药，多个标准对其含量均进行了控制。目前常用于测定蟾酥中有效有毒成分的方法主要为高效液相色谱法，也有一些使用了液质联用的检测手段，选用的指标参数也不尽相同[7-13]。

LC-MS/MS 具有分析速度快、检测灵敏度高、专属性强等优点，不需要复杂的前处理过程即可对中药中多种化学成分进行定性定量分析。本研究采用LC-MS/MS 法，对不同厂家生产的抗栓胶囊中华蟾酥毒基与脂蟾毒配基进行含量测定。

1.1 仪器

液相色谱质谱联用仪（1290/6470A 安捷伦科技有限公司）；
台式高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；
涡旋混合器（上海安谱实验科技股份有限公司）；
超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；
十万分之一分析天平（梅特勒托利多中国公司）。

1.2 药品与试剂

对照品：华蟾酥毒基（批号110803-201807，纯度99.6%）、脂蟾毒配基（批号110718-201809，纯度98.0%），均购自于中国食品药品检定研究院。

甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯；
水为超纯水。

抗栓胶囊29 批来源于9 家生产企业。其中安阳A 公司1 批，哈尔滨B 公司11 批，河北C 公司5批，青海D 公司1 批，山西E 公司2 批，山西F 公司2 批，陕西G 公司3 批，陕西H 公司1 批，郑州I 公司3 批。见表5。

2.1 高效液相色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax 300SBC18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；
流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：0.1%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱（程序为：0～7 min 60%A，7.5～10.5 min 10%A，11～15 min 60%A）；
柱温：40 ℃；
流速：0.2 mL·min-1，进样量：2 μL。

2.1.2 质谱条件 电喷雾（ESI）离子源，正离子扫描模式，监测模式为多反应监测（MRM）。毛细管电压：3.5 kV；
干燥气温度：300 ℃；
干燥气流速：6 L·min-1；
鞘气温度：250 ℃；
鞘气流速：11 L·min-1；
雾化器压力：310 kPa。各化合物监测离子对及质谱参数见表1。

表1 离子对及质谱参数

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品储备液 精密称取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品各约10 mg，置100 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 混合对照品中间液 精密量取混合对照品储备液1 mL，置100 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 混合对照品溶液 分别精密量取混合对照品中间液100、200、500 μL，1、2、4 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

对照品储备液、中间液、对照品溶液浓度信息见表2。

表2 标准储备液、中间液与对照品溶液浓度

2.2.4 供试品溶液 本品为原粉直接灌装而成，内容物即为粉末。取供试品粉末，混合均匀，取0.25 g，精密称定，置50 mL 离心管中，精密加入甲醇25 mL，密塞，涡旋混匀，超声处理20 min，8000 r·min-1离心6 min，上清液滤过，即得。

2.2.5 空白基质溶液 空白基质样品为缺蟾酥的抗栓胶囊阴性样品，来源于生产厂家。按“2.2.4”供试品溶液的制备方法处理，制成空白基质溶液。

2.3 专属性考察

取“2.2.3”项下标准曲线第4 个浓度点（1 mL 配制液）作为对照品溶液。另取缺蟾酥阴性样品适量，按“2.2.4”项下方法制备阴性对照溶液。

取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，分别进样，记录色谱图，见图1。结果表明，阴性基质对主成分测定无干扰，专属性良好。

图1 LC-MS/MS 图

2.4 线性关系考察

取“2.2.3”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱与质谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分浓度（ng·mL-1）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，各成分在各自浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。以3 倍信噪比和10 倍信噪比确定化合物在样品基质中的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。线性关系等见表3。

表3 线性关系与检出限、定量限

2.5 进样精密度试验

取“2.2.3”项下第4 个浓度点的对照品溶液之华蟾酥毒基浓度为108.860ng·mL-1，脂蟾毒配基浓度为108.560 ng·mL-1，按“2.1”项下色谱与质谱条件测定，连续进样6 次，根据测得值计算RSD，结果见表4，表明仪器精密度良好。

表4 精密度、重复性与加样回收率（n=6）

2.6 重复性试验

取同一批样品（哈尔滨B 公司，批号201102，编号10），按“2.2.4”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱与质谱条件进样测定，根据峰面积测得值，带入线性回归方程，计算出待测组分的浓度，再根据样品稀释倍数及称样量，计算得出样品中待测组分的含量（μg·g-1），计算RSD，结果见表4，表明方法的重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取同一批已知含量的样品（哈尔滨B 公司，批号201102，编号10）约0.1 g，精密称定，精密加入对照品中间液1mL，按“2.2.4”项下方法平行制备，按“2.1” 项下色谱与质谱条件测定，根据峰面积测得值，带入线性回归方程，计算出待测组分的浓度，再根据样品稀释倍数及称样量，计算得出加样样品中待测组分的含量（μg），计算回收率，结果见表4，表明该方法的准确度符合测定要求。

2.8 样品含量测定

精密称取不同厂家不同批号的抗栓胶囊，按“2.2.4”项下方法平行制备4 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱与质谱条件进样测定，根据抗栓胶囊的平均装量，计算得出29 批样品的含量（μg·粒-1）。结果见表5。

表5 29 批样品信息及其2 种成分含量测定结果（n=4）

3.1 检测方法的选择

传统HPLC 法测定蟾酥两种成分，仪器分析时间一般45～80 min，样品经提取后需浓缩5～10 倍，检测浓度为微克级。本实验采用LC-MS/MS 法，梯度洗脱，分析时间缩短为15 min；
样品经过超声提取后，直接稀释进样，简化了样品前处理过程；
检测浓度为纳克级，适合中药制剂中含量低、不易分离的化学成分的测定。

本研究前期参照了蟾酥含量测定的相关标准方法进行样品处理，并用高效液相色谱法进行测定。从液相图谱中显示，色谱峰较多又杂，主要指标成分与其他色谱峰未有较好分离，故采用LC-MS/MS 法对蟾酥中华蟾酥毒基与脂蟾毒配基进行含量测定。

3.2 色谱-质谱条件的确定

本研究考察了不同色谱柱的分离效果，结果显示，不同色谱柱分离效果未有明显差异，故选用常规Agilent ZORBAX 300SB-C18色谱柱。质谱条件中考察了离子监测模式，由于这两种成分均为酯类物质，易得到质子，故采用正离子模式。试验中流动相中加入适量甲酸，在正离子模式下响应高，峰形佳。

3.3 两成分含量结果分析

本研究参考《中国药典》2015、2020 版，抗栓胶囊已有国家标准及蟾酥成分研究已有相关文献，故选择华蟾酥毒基与脂蟾毒配基两种成分作为抗栓胶囊的指标成分。由测定结果可知，抗栓胶囊样品均含有华蟾酥毒基与脂蟾毒配基，但不同厂家不同批次的抗栓胶囊差异十分明显，除哈尔滨B 公司外的其他厂家因抽验批数较少缺乏统计学意义。哈尔滨B 公司样品共涉及11 个批号，不同批号间RSD为6.5%左右，含量区间为5.3 μg·粒-1～6.7 μg·粒-1。有部分厂家测得的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量极低，且批间数据差异较大，因蟾酥在该品处方中配比较低，可能存在生产配制过程中混合不均或损耗等情况，这可能会对临床疗效产生较大差异，故考虑根据《中国药典》蟾酥中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量及抗栓胶囊处方中各药味比例进行蟾酥含量折算并拟定限度（因是原粉入药，转移率以70%计），从而用一个统一的指标评价市场上抗栓胶囊的质量。由此作为指标成分之一，对之后建立抗栓胶囊质量控制的国家标准、评价抗栓胶囊质量有一定的指导意义。

本研究建立了定量测定抗栓胶囊中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的LC-MS/MS 法，结果显示，该方法操作简单、检测快速、灵敏度高、重复性好，可用于抗栓胶囊的质量控制。