溃疡性结肠炎患者血清外泌体miRNA-221水平及临床意义

董丽丽 李 珍 徐 蓉 丁 芳 李华铭

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)在我国的发生率逐年升高，已有研究证实，西化的生活方式、饮食、环境、基因和自身免疫因素均可能导致UC的发生。研究发现，UC发病反复等特点可增加患结直肠癌的风险。既往研究表明，UC患者患癌的标准化发生率为3.7%～5.7%。近年来研究指出，实际UC转罹患癌的概率已大幅降低，可能与改善治疗管理有关。结肠镜检查是判断UC患者肠道黏膜状况的金标准，但其属于侵入性检查，耗时较长且不能实时动态评估患病情况。因此，临床上筛选出敏感、准确的生物学标志物，对于改善患者的预后至关重要。微RNA(microRNA，miRNA)是一种小的非编码RNA，长度为18～25个核苷酸。miRNAs广泛参与UC的病理生理过程，其在UC活动期与缓解期的表达均有所不同。据报道，miRNA-221可通过转录后基因沉默机制促进结直肠癌的发生、发展。本研究拟通过检测UC患者血清外泌体miRNA-221的表达水平探讨其具有的临床意义，以期为临床诊疗提供参考。

1.一般资料：选取2020年1月～2021年1月在笔者医院收治的UC患者80例作为病例组，另选取同期60例健康体检者作为对照组。本研究获得笔者医院医学伦理学委员会批准(伦理学批号：KL201031)，所有研究治疗和检测方法均取得患者或家属知情同意。纳入标准：①诊断符合2012年广州炎症性肠病诊断与治疗的共识意见；
②年龄18～70岁。排除标准：①恶性肿瘤患者；
②慢性心脏、肝脏、肾脏疾病患者；
③伴有中毒性结肠扩张、结肠狭窄、梗阻、穿孔等；
④检查资料不完整的患者。收集患者的临床基线数据包括年龄、性别、体重、吸烟史、红细胞沉降率、基底浆细胞。

2.UC内镜活动度分级：采用Mayo评分评价UC临床活动度，包含4个评分项目，每项0～3分。(1)排便次数：①排便次数正常；
②比正常排便次数增加1～2次/天；
③比正常排便次数增加3～4次/天；
④比正常排便次数增加5次/天或以上。(2)便血：①未见出血；
②不到一半时间内出现便中混血；
③大部分时间内为便中混血；
④一直存在出血。(3)内镜发现：①正常或无活动性病变；
②红斑、血管纹理减少、轻度易脆；
③明显红斑、血管纹理缺乏、易脆、糜烂；
④自发性出血、溃疡形成。(4)医生总体评价：①正常；
②轻度病情；
③中度病情；
④重度病情。症状缓解：Mayo评分≤2分，轻度活动：3分≤Mayo评分≤5分；
中度活动：6分≤Mayo评分≤10分；
重度活动：11分≤Mayo评分≤12分。

3.UC严重度指数：采用UC内镜下严重度指数(UCEIS评分)进行评分，包含血管纹理、出血情况、糜烂和溃疡3个方面。血管纹理评分范围为0～2分，出血情况为0～3分，糜烂和溃疡为0～3分，分数越高代表越严重。轻度患者：2分≤UCEIS评分≤3分；
中度患者：4分≤UCEIS评分≤6分；
重度患者：7分≤UCEIS评分≤8分。

4.血清采集：患者入院隔日采集空腹静脉血5ml，室温静止30min后，4℃ 4000r/min离心15min。取血清到新的收集管后，再4℃ 12000r/min离心10min除去细胞碎片，-80℃保存备用。

5.指标检测：采用速率比浊法检测C反应蛋白(CRP)水平，HE染色测定基底浆细胞，间接免疫荧光法检测抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)。

6.试剂和仪器：
SYBRPrimeScriptmiRNA RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；
PCRStripTubes购自美国Axygen公司；
TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；
ABI-7300荧光定量PCR仪购自美国Ambion公司；
引物设计与合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

7.引物设计与合成:根据GenBank序列设计引物，miRNA-221上游引物：5′-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3′；
下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。内参β-actin上游引物:5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

8.实时定量PCR:用PrimeScriptRT-PCR试剂盒将样本提取后的RNA转化成cDNA，使用ABI-7500荧光实时定量PCR仪进行PCR扩增及检测miRNA-221水平。miRNA-221及内参β-actin的扩增产物长度分别为110、112bp。RT-PCR反应体系：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火30s，最后72℃延伸30s，循环40次。

1.两组一般临床资料及血清miRNA-221比较：两组年龄、性别、BMI比较，差异无统计学意义(>0.05)。病例组红细胞沉降率、基底浆细胞、CRP、miRNA-221水平高于对照组(<0.05)，详见表1。

2.不同内镜活动度UC患者血清miRNA-221水平比较：重度活动组、中度活动组患者血清miRNA-221水平均高于轻度活动组，重度活动组血清miRNA-221水平高于中度活动组(均<0.05)，详见表2。

3.不同UC严重度指数患者血清miRNA-221水平比较：重度、中度患者血清miRNA-221水平高于轻度患者，重度患者血清miRNA-221水平高于中度患者(均<0.05)，详见表3。

4.UC患者血清miRNA-221水平与临床参数相关性：血清miRNA-221与红细胞沉降率、基底浆细胞、CRP、Mayo评分、UCEIS评分呈正相关(均<0.05)，详见表4。

5.血清miRNA-221水平对UC、UC内镜下活动度、UC严重程度的诊断价值：血清miRNA-221在预测发生识别UC、UC内镜下活动度、UC严重程度的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.786(95%CI：0.713～0.857)、0.674(95%CI：0.576～0.771)、0.801(95%CI：0.725～0.887)，详见表5和图1。

研究显示，肿瘤或炎症性疾病患者的circRNA可抑制miRNA功能，调控基因表达，从而影响表型。lncRNA H19可通过调控miRNA-675-5p表达，间接调控肠上皮细胞屏障功能相关蛋白VDR、ZO-1等的表达，从而导致UC发生。miRNA-221与多种炎性疾病关系密切，是一种功能性miRNA。既往研究指出，miRNA-221在UC患者中异常表达能通过调节炎性细胞因子水平参与到UC的发病过程。本研究结果提示，miRNA-221相对表达量是UC发病的危险因素，其发病可能与miRNA-221因子参与UC的发生、发展过程有关。研究表明，慢性炎症与癌症发展之间存在关联。通过激活炎性细胞因子IL-6促进上皮细胞和免疫细胞正常分泌向恶性细胞转变。据报道，结肠炎相关的结肠癌中已经发现有炎性反应，但尚不清楚这些炎症是否与信号调节的通路相同。本研究显示，miRNA-221作为炎症效应分子在UC患者中表达失调，提示其在结直肠癌发生中的重要性。

目前，临床上常用UCEIS评分和Mayo内镜评分评价UC患者的黏膜病变程度，而Mayo内镜评分以黏膜脆性为分级标准，由于知识和经验掌握程度不同，致使各医生对UC患者的评估结果各异，容易影响结果判断的准确性。而UCEIS主要从糜烂和溃疡、出血情况、血管纹理3方面进行黏膜病变评价，判断标准上容易量化，对黏膜病变程度的评价更为细致。研究显示，UCEIS评价UC患者临床转归及远期预后方面的准确度高于Mayo内镜评分。本研究结果显示，miRNA-221与UCEIS评分和Mayo内镜评分密切相关，提示miRNA-221在UC患者临床转归及远期预后方面也可能发挥重大作用。研究表明，miRNA-221可参与调节单核细胞及巨噬细胞的分化等多种生理活动。此外，有多项研究表明，miRNA-221与肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌及胶质瘤等发生有关。

研究表明，miRNA-17-92、miRNA-21家族在肿瘤组织中常表达异常，非酒精性脂肪性肝病小鼠T细胞中可见170种miRNA，其中大部分通过MAPK信号通路表达下调。miRNA因其稳定性和多样性等特点，被广泛用于疾病治疗、诊断以及预后评估，可作为分子标志物。慢性UC反复发作可演变为结直肠癌，是UC最严重的并发症。基于miRNA-221在UC相关结肠癌患者中的独特表达模式，其可能是UC发病机制中重要的调节因子。笔者研究结果表明，miRNA-221可以作为一种生物学标志物，用于识别有这种恶性转化风险的患者。本研究还表明，miRNA-221表达水平与UC活动和疾病持续时间密切相关，这为当前临床诊疗指南提供分子生物学基础。

综上所述，溃疡性结肠炎血清miRNA-221水平升高，血清miRNA-221水平与溃疡性结肠炎疾病严重程度呈正相关，其表达水平有助于早期识别评估UC的发展阶段和疾病严重程度，可作为早期诊治的生物学标志物。