HMGB1抑制剂预处理对大鼠心肺复苏后脑缺血再灌注损伤及TLR4/NF-κB信号通路的影响

王华杰 苏醒 麦叶 吴远怡 顾勇

心跳骤停及心肺复苏可造成脑缺血再灌注损伤，导致神经损伤和脑功能障碍，出现永久性脑损伤[1-2]。乌司他丁可减轻心肺复苏后脑损伤，但乌司他丁于临床应用中可出现粒细胞减少、腹泻和肝功能损伤等不良反应[3]，因此找到更为安全有效的药物治疗心肺复苏后脑损伤具有重要意义。高迁移率族蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB1)在机体各组织中广泛表达，可调控免疫炎症、细胞凋亡和氧化应激等多种生理、病理过程[4]，其抑制剂甘草酸可减轻急性心肌梗死大鼠炎症反应，保护心肌组织[5]，还可改善创伤性颅脑损伤后神经功能[6]。Toll样受体4(toll- like receptor 4，TLR4)/核转录因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)是HMGB1调节炎症反应的下游信号通路[7]，抑制其表达，可减轻小胶质诱导的神经炎症[8]，减轻脑脑缺血再灌注损伤[9]，推测下调TLR4/NF-κB通路可能是HMGB1抑制剂降低大鼠心肺复苏后脑缺血再灌注损伤的药理机制之一。本文拟通过建立心肺复苏大鼠模型，探讨HMGB1抑制剂对心肺复苏后大鼠的脑缺血再灌注损伤是否具有治疗效果，并阐明其内在机制。

1.1 材料

1.1.1动物：SPF级SD大鼠〔康美华大基因技术有限公司，许可证号SYXK(粤)2019-0205〕，雄性，体重200～240 g。饲养室饲养(光照交替12 h/12 h，25℃，湿度50%)，自由饮食，确保室内通风且环境清洁。

1.1.2试剂及仪器：甘草酸(货号：SG8600)购自上海恒斐生物科技有限公司；
乌司他丁(国药准字：H19990134)购自广东天普生化医药股份有限公司；
大鼠中枢神经特异性蛋白(S100β) ELISA试剂盒(货号：YS04063B)购自上海雅吉生物科技有限公司；
大鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE)ELISA试剂盒(货号：SBJ-R0081)购自南京森贝伽生物科技有限公司；
大鼠IL-6、TNF-α ELISA试剂盒、NF-κB p65一抗、羊抗兔二抗(货号：ab100772、ab16502、ab150077)购自美国Abcam Plc公司。酶标仪(XElx800)购自美国Perkin Elmer股份有限公司；
蛋白电泳仪、转膜仪(Mini PROTEAN)购自美国Bio-Rad公司；
凝胶成像系统(2500)购自上海天能生物科技有限公司；
离心机(Centrifuge 5424R)购自德国Eppendorf股份公司。

1.2 方法

1.2.1动物模型制备及分组给药：依据参考文献方法构建模型[10]，所有大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉大鼠，将其以仰卧位固定于操作台上，颈部备皮，以16 G鞘管经口气管插管后连接动物呼吸机进行心电监护，在颈部中间做一约1 cm切口暴露位于左侧的股动脉，插入留置管监测各组大鼠血压。于呼气结束时用动脉夹封闭气管，封闭时间3～4 min，同时注射冰氯化钾(0.5 mol/L)至颈动脉，待心电图走势趋于直线后马上机械通纯氧(80次/min，潮气量6 mg/kg)，同时按压胸外心脏(180次/min)，直至心跳恢复。以平均动脉压>50 mmHg且持续10 min为构模成功，将模型构建成功的大鼠共60只随机分为模型组、甘草酸低剂量组、甘草酸中剂量组、甘草酸高剂量组、乌司他丁组，每组各12只。另设假手术组12只，参照上文操作，仅暴露气管，随后立即缝合。

配制不同浓度的甘草酸溶液(1、2、3 mg/mL，生理盐水稀释)，甘草酸低、中、高剂量组大鼠分别灌胃上述稀释的溶液10 mL/kg，按体重1 mL/kg尾静脉注射生理盐水；
乌司他丁组大鼠尾静脉注射乌司他丁注射液(50000 U/mL)1 mL/kg[11]，并按体重予生理盐水10 mL/kg灌胃；
假手术组、模型组同时按体重生理盐水10 mL/kg灌胃并1 mL/kg尾静脉注射，各组均持续7 d。

1.2.2血液指标检测：末次给药24 h后，采集各组所有大鼠尾静脉血1.5 mL，静置20 min后4℃下以1000 r/min、离心半径10 cm，离心15 min，取上清液，分别按照大鼠S100β、NSE ELISA试剂盒方法检测S100β、NSE水平。

1.2.3神经功能缺损评分：尾静脉采血后，各组所有大鼠采用Longa分级法[13]进行评分：神经功能无明显损伤，0分；
前爪伸展困难且不完全，1分；
行走时出现转圈现象，2分；
行走时出现倾倒现象，3分；
丧失正常行为能力，4分；
死亡，5分。

1.2.4脑组织指标检测：评分结束后，迅速麻醉大鼠并处死，剥离脑组织，每组随机选取6只大鼠称重(湿重)，随后烘干，称量干重，得出脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

各组剩余的6只大鼠大脑中剪取约1 g脑组织，加入蛋白裂解液、匀浆、4℃离心25 min(3000 r/min，离心半径10 cm)、吸出上清液，以BCA试剂盒测得蛋白总浓度，然后从中取500 μL分别按照相应ELISA试剂盒方法检测IL-6、TNF-α水平。

(1)Western blot法检测：参照SDS-PAGE凝胶制备试剂盒方法配制浓缩胶、分离胶，取含有20 μg总蛋白的样品液进行电泳，电泳结束后转膜处理。5%脱脂奶粉封闭2 h，依次进行TLR4、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65一抗、二抗孵育，滴加显色液处理，凝胶成像系统拍照。Quantity One软件分析条带图像，定量其灰度值，以GAPDH作为内参，计算各组蛋白与GAPDH蛋白的灰度值的比值，记作蛋白相对表达量。

(2)HE染色检测：将剩余大脑组织用生理盐水洗净，4%多聚甲醛固定，不同浓度酒精由低到高梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制作切片(4 μm)若干。脱蜡后不同浓度酒精由高到低梯度处理，按照试剂盒方法染色，蒸馏水洗净后脱水处理并封片，置于400倍光学显微镜下，观察神经元受损程度。

2.1 各组大鼠脑损伤情况比较具体见图1、表1。假手术组大鼠神经元完好无损伤，胞浆、核、核仁结构均正常，神经功能缺损评分为0。与假手术组相比，模型组大鼠神经元受损明显，存在变性、核皱缩等现象，神经功能缺损评分、血清S100β、NSE水平明显升高(P<0.05)。与模型组相比，乌司他丁组、甘草酸低剂量组、甘草酸中剂量组、甘草酸高剂量组大鼠神经元损伤逐渐恢复，神经功能缺损评分、血清S100β、NSE水平降低，且甘草酸各剂量组间随剂量增高而降低(P<0.05)。甘草酸高剂量组与乌司他丁组相比上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。

注：A：假手术组；
B：模型组；
C：甘草酸低剂量组；
D：甘草酸中剂量组；
E：甘草酸高剂量组；
F：乌司他丁组 图 1 各组大鼠脑组织神经元损伤情况比较(HE×400)

表1 各组大鼠神经功能缺损评分及血清S100β、NSE水平比较

2.2 各组大鼠脑组织相关指标比较与假手术组相比，模型组大鼠脑组织IL-6及TNF-α水平，p-NF-κB p65/NF-κB p65及TLR4、MyD88蛋白表达及脑组织含水量明显升高(P<0.05)。与模型组相比，甘草酸低剂量组、甘草酸中剂量组、甘草酸高剂量组、乌司他丁组大鼠脑组织IL-6及TNF-α水平，p-NF-κB p65/NF-κB p65，TLR4、MyD88蛋白表达及脑组织含水量降低，且甘草酸各剂量组间随剂量增高而降低(P<0.05)。甘草酸高剂量组与乌司他丁组相比上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。具体见图2、表2。

注：A：假手术组；
B：模型组；
C：甘草酸低剂量组；
D：甘草酸中剂量组；
E：甘草酸高剂量组；
F：乌司他丁组；
TLR4：Toll样受体4；
MyD88：髓样分化因子88；
NF-κB：核转录因子-κB；
GAPDH：内参 图 2 各组大鼠脑组织TLR4/NF-κB通路蛋白表达量(Western blot)

表2 各组大鼠脑组织检测指标比较

脑复苏是心跳骤停患者心肺复苏后预后的关键因素，减轻心肺复苏时引起的脑缺血再灌注损伤是促进脑复苏的途径之一[13]。本文通过建立心肺复苏大鼠模型对心肺复苏后脑缺血再灌注损伤进行研究，结果显示，模型组大鼠脑组织神经元损伤严重，具有典型变性、核皱缩现象，神经功能缺损评分及脑组织含水量明显升高；
脑损伤指标S100β和NSE以及脑炎症因子IL-6、TNF-α水平也明显升高，表明模型大鼠在心肺复苏过程中血脑屏障破坏，脑组织内产生炎症，引发神经元损伤和水肿，具有明显的再灌注损伤症状，表明模型构建成功。

HMGB1参与介导脑缺血再灌注损伤的病理生理过程[14]，其抑制剂甘草酸可通过抑制炎症减轻脑水肿、神经元损伤等病理症状，修复脑功能，因此推测甘草酸对心肺复苏后脑缺血再灌注损伤可能有治疗作用。本文选用不同剂量甘草酸处理，发现甘草酸可减轻大鼠脑神经元细胞损伤，降低其神经功能缺损评分、脑组织含水量、血清中S100β及NSE水平、脑组织IL-6及TNF-α水平，随着甘草酸剂量升高，效果愈加明显，且高剂量甘草酸的功效与阳性对照药乌司他丁相似，这表明甘草酸可减轻心肺复苏大鼠脑水肿及炎症反应，降低神经元损伤，恢复神经功能，并随剂量升高而作用增强。

既往研究发现，TLR4/NF-κB信号通路参与脑缺血再灌注损伤过程，抑制其表达可减轻脑损伤[15]，因此TLR4/NF-κB信号是减轻心肺复苏后脑缺血再灌注损伤的潜在作用靶点。本研究观察HMGB1抑制剂甘草酸是否可以调控心肺复苏后脑损伤过程中TLR4/NF-κB通路表达，结果发现甘草酸可降低模型大鼠脑组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达，且随着甘草酸剂量升高，效果愈加明显，表明其可下调TLR4/NF-κB信号通路蛋白表达，保护心肺复苏后脑组织免于损伤。

综上所述，本研究结果显示HMGB1抑制剂甘草酸对心肺复苏后脑缺血大鼠模型具有缓解脑水肿和炎症反应，恢复神经损伤，保护神经功能，其药理机制可能是通过抑制TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达而下调TLR4/NF-κB信号表达，这可能为治疗相关疾病提供了新的思路，但HMGB1抑制剂作用方式多样，还可能通过调控其他通路间接影响疾病发展，具体有待后续的深入研究。