参苓白术散早期干预对噁唑酮诱导过敏性结肠炎幼鼠的影响

叶丽妍，曾丽盈，陈佩文，叶绮娜，赖东兰，陈晓刚*

（1.广州中医药大学 第一临床医学院，广东 广州 510405；
2.广州市妇女儿童医疗中心 儿科，广东 广州 510623；
3.广州中医药大学 第一附属医院 儿科，广东 广州 510405）

食物过敏（food allergy，FA）是一种对特定食物抗原的不良反应，由免疫机制介导、发生在对特定过敏源敏感的个体身上，会导致组织和器官功能紊乱甚至损伤而引起一系列临床表现。FA常常发生在婴幼儿时期，其中胃肠道症状出现较早。流行病学调查显示，中国珠海、浙江、重庆3城市2岁以下儿童食物过敏检出率约为5.6%～7.3%［1］，澳大利亚的1岁婴儿群体中，超过10%的婴儿存在常见食物过敏［2］，不同的食物引起的发病率亦不同［2-3］。过敏性结肠炎（allergic colitis，AC）为食物过敏所导致的一种消化道疾病，常见临床表现为腹泻和便血，以迁延性、慢性腹泻多见，病程长短不一，严重者可出现低蛋白血症、脏器功能紊乱，会影响患儿的生长发育，远期可能还与支气管哮喘、过敏性鼻炎等多种过敏性疾病相关。AC目前尚无特效治疗手段，主要以回避过敏食物、口服胃肠黏膜保护剂、微生物制剂等对症治疗，但仍有部分患儿疗效欠佳，反复发作。因此，寻找、探索早期干预以减轻过敏性结肠炎的防治方法是目前临床研究的重要方向。有临床研究提示，参苓白术散可有效防治过敏性结肠炎、过敏性鼻炎、支气管哮喘等，动物实验也表明其能减轻溃疡性结肠炎大鼠的肠道炎症反应［4-9］。本研究用噁唑酮诱导法建立幼年小鼠的AC模型，试图探索参苓白术散早期干预影响婴幼儿AC的药理机制。

1.1 研究材料

1.1.1 实验动物

150只7 d龄健康雌性BALB／c幼鼠，购于广州中医药大学实验动物中心（实验动物使用许可证：SYXK［粤］2018-0001，实验动物生产许可证：SYXK［粤］2018-0034），体质量为4～8 g／只，饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF级动物实验室，恒温（22±1）℃，相对湿度50%～70%，幼鼠3周龄前由母鼠哺乳喂养，3周龄后自行摄食、饮水，昼夜循环光照。本研究伦理问题经广东中医药大学第一附属医院实验中心审批（批号：TCMF1-2019005）。

参苓白术散的组成：按《太平惠民和剂局方》所载，莲子肉（去皮）、薏苡仁、缩砂仁、桔梗、白扁豆（炒）、白茯苓、人参、炙甘草、白术（麸炒）、山药共10味药按2∶2∶2∶2∶3∶4∶4∶4∶4∶4的比例配伍，以上10味中药由广州中医药大学第一附属医院中药房提供，用单蒸水洗涤后，入三角瓶中加4倍体积的双蒸水浸泡2 h（人参另泡另煎），煎2次，每次煎30 min，去渣，两煎液混合，G4滤器过滤，于60℃水浴中浓缩成每毫升药液含原药材2.56 g（即生药质量浓度2.56 g／mL），密封4℃保存备用。酪酸梭菌（CGMCC313-1）由山东科兴生物制品有限公司惠赠。

1.1.2 试剂与仪器

小鼠白介素4（interleukin 4，IL-4）、白介素10（interleukin 10，IL-10）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA试剂盒购自Elabscience公司，小鼠白介素13（interleukin 13，IL-13）ELISA试剂盒购自Boster公司，早幼粒白血病锌指蛋白（promyelocytic leukemia zinc finger protein，PLZF）一抗购自Abcam公司、GAPDH一抗购自BIOSS公司，Goat anti-rabbit IgG（H+L）HRP二抗、Goat anti-mouse IgG（H+L）HRP购自Bioworld公司，PVDF膜购自Millipore公司，1.5 mol／LTris-HCl pH 8.8、1.0 mol／L Tris-HCl pH 6.8、TBST缓冲液购自广州蓝吉生物公司，甘氨酸、Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、脱脂奶粉、SDS购自BIOFROXX公司，过硫酸铵、TEMED购自北京普利莱公司，显影粉、定影粉购自天津世纪奥博公司，还原型SDS-PAGE 5×Loading Buffer购自CWBIO公司，PageRuler Prestained Protein Ladder（26616）购自Thermo scientific公司，超敏ECL化学发光即用型底物购自BOSTER公司，无水乙醇、无水甲醇、水合氯醛购自天津大茂公司，PBS液购自Thermo Fisher Scientific公司，噁唑酮购自Sigms-Aldrich公司，PE导管（P50）购自Smith Medical公司，无酶EP管购自AXYGEN公司，24G贝朗安全型新生儿留置针头、1 mL及2.5 mL无菌注射器等均由广州中医药大学第一附属医院儿科提供。

全自动样品快速研磨仪（JXFSTPRP-24）购自上海净信公司，脱色摇床（TS-1）购自海门其林贝尔公司，冷冻高速离心机（TGL-18R）购自珠海黑马公司，旋涡振荡器（QL-901）购自海门麒麟公司，电热恒温水槽（DK-8D）购自上海一恒公司，PH计（ST3100）购自奥豪斯仪器公司，X射线摄影暗匣（AX-Ⅱ）购自广东粤华公司，自动酶标仪（RT-6000）购自深圳雷杜公司，数码凝胶图像分析系统（LG2000）购自杭州朗基公司，电泳、电转系统（Mini）购自Bio-rad公司，酶标分析仪、低温高速离心机购自Thermo Scientific公司，电热恒温摇床（KS 3000i control）购自IKA公司，-80℃超低温冰箱购自中科美菱公司，十万分电子分析天平（MS半微量型号）购自赛多利斯公司，快速混匀器购自国华公司，动物剃毛器购自科德士公司等。

1.2 研究方法

1.2.1 实验分组与给药方法

150只幼鼠分两批进入实验（第1批60只，第2批90只），各自随机分为空白组、参苓白术散高剂量组、参苓白术散中剂量组、参苓白术散低剂量组、益生菌组和模型组，第一批每组各10只，第二批每组各15只。

连续灌胃17 d，1次／d（实验第0～16天），参苓白术散高剂量组小鼠每kg体质量每次给予含生药量25.6 g的参苓白术散煎液，中剂量组予12.8 g／次，低剂量组予6.4 g／次，所有参苓白术散煎液均稀释为25 mL／kg后，使用新生儿留置针经口灌胃给参苓白术散各剂量组小鼠；
益生菌组给予酪酸梭菌（109cfu），将酪酸梭菌稀释为25 mL／kg的混悬液后灌胃给小鼠，模型组及空白组均按25 mL／kg灌胃PBS液。

至实验第17天，幼鼠腹部皮肤剃毛2 cm×2 cm，模型组、参苓白术散各剂量组及益生菌组均予0.2 mL 3%噁唑酮100%乙醇溶液皮肤滴注致敏，空白组则给予等体积的PBS液皮肤致敏，自然风干，24 h后（实验第18天）重复一次。5 d后（实验第23天）行结肠灌注，先予麻醉剂（每100 g幼鼠体质量注射0.3 mL）腹腔注射麻醉，用自制灌肠器（2.5 mL注射器连接内径0.58 mm的PE导管）插入幼鼠肛门约3～4 cm，模型组、参苓白术散各剂量组及益生菌组均予0.15 mL 1%噁唑酮50%乙醇液灌肠，空白组则给予等体积的PBS液灌肠。抽取液体，沿导管缓缓注入，倒置幼鼠60 s，令致敏液与结肠充分接触。灌肠第2天后连续3 d（实验第24～26天），每日记录幼鼠体质量、大便性状及便隐血情况，进行DAI评分，若幼鼠进食减少、体质量减轻、毛色无光泽、懒动、活动量减少、出现稀便或便血试验阳性，认为造模成功表现。

结肠灌注3 d后（实验第26天）取材，麻醉后处死幼鼠，沿腹中线剪开皮肤，打开腹腔暴露结肠，取病变明显处结肠组织，小心刮去粪便等内容物后，剪取3段（每段约1～1.5 cm），用PBS液冲洗干净，其中一段以4%中性甲醛固定用于常规HE染色，光镜下观察评价病理改变，其余两段分别放入洁净EP管中，-80℃保存待测相关细胞因子及PLZF蛋白表达水平。

图1 实验流程图Figure 1 Experimental procedure

1.2.2 分析幼鼠疾病活动指数评分

自灌肠第2天（实验第24天）起至实验结束（实验第26天），每天观察记录各组幼鼠的体质量、大便性状及便血情况，便隐血检测采用匹拉米酮法，按Okayasu等标准分析幼鼠疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分（表1），DAI＝（体质量下降分数+大便性状分数+便血分数）／3。

表1 DAI评分表Table 1 DAI score

1.2.3 观察幼鼠结肠组织病理改变

取4%中性甲醛固定的结肠组织，石蜡包埋，切片，常规HE染色，光镜下观察，参照Ekstrom等的标准，根据上皮损伤、水肿、淋巴细胞／单细胞／浆细胞浸润、中性粒细胞浸润和嗜酸性粒细胞浸润等评价病理改变（表2）。

表2 结肠组织病理学评分（HPS）1）Table 2 Histopathological score（HPS）1）of colon

1.2.4 检测幼鼠结肠IL-4、IL-13、IFN-γ、IL-10水平

从-80℃冰箱取出冻存结肠组织，快速称质量，分两次加入共1mL PBS液，研磨充分，室温下静置3～5 min，4℃，11 000 g离心15 min，取上清液备用，依照试剂盒要求实施实验步骤：稀释IL-4、IL-13、IFN-γ、IL-10标准品和样品，设立各组，加样，温育，洗板，加酶，显色，利用酶标仪测定450 nm的吸光值A（450 nm），根据A（450 nm）值绘制相应的标准曲线，得出方程式计算待测结肠标本的细胞因子浓度。

1.2.5 检测幼鼠结肠PLZF的蛋白表达

结肠标本加入裂解液，破碎后取0.5 mL组织匀浆液转移到洁净的1.5 mL离心管，加入1 mL抽提试剂充分混匀，室温静置10 min，4℃，10 000 g离心10 min，吸去上下层液体，敞开管口，干燥蛋白沉淀；
BCA蛋白定量法测定结肠组织总蛋白质量浓度；
制备SDS-PAGE电泳胶放入电泳槽中，将提取到的总蛋白上样20μg，通电开始电泳分离样品：跑浓缩胶的电压在80 V，约30 min，跑分离胶的电压在120 V，约60 min，当溴芬蓝跑至离胶底端1～2 cm左右停止电泳。将蛋白转至PVDF膜，转膜结束后5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，然后倒掉封闭液、TBST缓冲液洗膜（5 min／次，共6次）、加入PLZF一抗溶液（VPLZF一抗∶V抗体稀释液＝1∶500）4℃孵育过夜，同样TBST缓冲液洗膜、加入二抗溶液（V二抗∶V抗体稀释液＝1∶4 000），室温孵育2 h，洗膜后用ECL显色试剂盒显色，洗片进行显影和定影。

1.3 统计学分析

使用SPSS 25.0统计软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，方差齐性选用Levene F检验，方差齐者，以LSD法进行组间两两比较，方差不齐则选用Dunnet T3检验；
不符合正态分布者以中位数（四分位数间距）［M（P25～P75）］表示，采用非参数检验（Kruskal-Wallis H法）；
检验以P＜0.05为差异具有统计学意义。

在实验过程中，空白组死亡16只，参苓白术散高剂量组死亡17只、中剂量组死亡17只、低剂量组死亡14只，益生菌组死亡16只，模型组死亡15只，共死亡95只。最终用于实验分析55只。

2.1 幼鼠灌肠后一般情况及DAI评分结果

空白组：幼鼠体毛细软，光泽度好，精神活力良好，体质量平稳增长，大便呈干燥颗粒状，便隐血试验阴性。

模型组：从灌肠后至处死前，毛发散乱无光泽，大便性状由干燥颗粒状转为松软半成形，体质量未见明显减轻，但活力差，懒动多卧，便隐血试验多数为阳性。

参苓白术散高剂量组：灌肠后第1天体质量明显下降，第2天开始逐渐回升，活力一般，喜扎堆，大便性状与灌肠前基本无异，呈干爽颗粒状，但便隐血试验多数为阳性。

参苓白术散中剂量组：灌肠后体质量基本维持稳定增加，大便松软半成形、次数正常，但便隐血试验基本为阳性。

参苓白术散低剂量组：大便性状由干转稀、次数增多，潜血试验阳性持续存在，灌肠后第1天有明显的体质量下降，之后体质量恢复增加，精神活力反应亦有所好转。

益生菌组：体质量减轻情况较轻微，大便性状与灌肠前无异，多为干燥颗粒状，便隐血试验偶有阳性。

灌肠后第1天，模型组DAI评分高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示造模成功。参苓白术散高、中、低剂量组DAI评分均高于模型组，益生菌组DAI评分低于模型组，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。灌肠后第2天，模型组DAI评分高于空白组，参苓白术散高剂量组及益生菌组DAI评分均低于模型组，而参苓白术散中、低剂量组DAI评分高于模型组，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。灌肠后第3天，模型组DAI评分高于空白组，差异具有统计学意义（P＜0.01），参苓白术散高、中、低剂量组DAI评分均高于模型组，益生菌组DAI评分低于模型组，但差异均无统计学意义（P＞0.05），如表3、图2所示。

表3 灌肠后各组幼鼠DAI评分Table 3 DAI scores of juvenile mice in each group after enema［M（P25～P75）］／分

2.2 幼鼠灌肠后的体质量变化

灌肠后各组小鼠体质量整体呈增长趋势，但各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。各组幼鼠灌肠后的体质量变化如表4和图3所示。

图2 灌肠后3 d各组幼鼠DAI评分的变化Figure 2 Changes of DAI scores of juvenile mice in each group 3 days after enema

图3 1%噁唑酮50%乙醇液灌肠后各组幼鼠体质量变化Figure 3 Change in body weight of juvenile mice in each group after enema by 1% oxazolone 50% ethanol

表4 各组幼鼠灌肠后的体质量变化Table 4 Change in body weight of juvenile mice in each group after enema（）／g

表4 各组幼鼠灌肠后的体质量变化Table 4 Change in body weight of juvenile mice in each group after enema（）／g

2.3 幼鼠结肠组织镜下病理改变情况

空白组：黏膜结构完整，各细胞排列整齐，上皮无损伤，无溃疡形成，黏膜下层见少量淋巴细胞和中性粒细胞轻度浸润，无嗜酸性粒细胞浸润（图4）。

参苓白术散高剂量组：黏膜上皮损伤情况轻，腺窝结构基本正常，轻度水肿，肌层见淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞等中度浸润，无嗜酸性粒细胞浸润（图4）。

参苓白术散中剂量组：上皮损伤，无溃疡形成，轻度水肿，个别腺窝结构消失，有大量炎性细胞浸润至肌层，未见嗜酸性粒细胞浸润（图4）。

参苓白术散低剂量组：黏膜存在上皮损伤，未见溃疡，偶发腺窝结构消失，轻度水肿，炎性细胞浸润情况较中剂量组轻（图4）。

益生菌组：黏膜上皮结构较整齐，腺窝结构正常，肌层见少量淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞浸润，无嗜酸性粒细胞浸润（图4）。

模型组：黏膜上皮损伤，但未形成溃疡，轻度水肿，大量淋巴细胞、单核细胞、浆细胞及中性粒细胞浸润至浆膜层，未见嗜酸性粒细胞浸润（图4）。

图4 幼鼠结肠组织镜下病理改变Figure 4 The microscopic pathological changes of colonic tissue

空白组幼鼠HPS有分值，镜下显示有炎症细胞浸润，考虑为灌肠操作本身对幼鼠是一种炎症刺激因素，会对幼鼠的病理变化造成一定的影响。空白组与模型组比较，模型组HPS评分高于空白组，参苓白术散高、中、低剂量组和益生菌组HPS评分均高于模型组，但均无统计学差异（P＞0.05）。如表5、图5所示。

图5 各组幼鼠结肠组织病理学评分（HPS）Figure 5 HPSof juvenile mice colonic tissue in each group

表5 各组幼鼠结肠组织病理学评分（HPS）Table 5 HPSof juvenile mice colonic tissue in each group［M（P25～P75）］／分

2.4 参苓白术散对幼鼠结肠IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ含量的影响

研究发现，参苓白术散改善结肠炎动物模型病理损伤及降低DAI评分的作用，可呈现剂量依赖性特点，但其对细胞因子等的影响则常常无此表现［10-12］，故本研究只选取参苓白术散高剂量组进行后续研究。随机选择空白组、参苓白术散高剂量组、益生菌组及模型组各5个样本，检测结肠IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ含量。模型组的IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ含量与空白组比较无显著差异（P＞0.05）。参苓白术散高剂量组IL-4、IL-10、IL-13和IFN-γ含量均高于模型组，其中IL-10、IFN-γ的增高有统计学差异（P＜0.01，P＜0.05）。此外，参苓白术散高剂量组的上述4种细胞因子含量均高于益生菌组，其中IL-10、IFN-γ的增高有显著性差异（均为P＜0.01），如表6、图6所示。

图6 各组幼鼠结肠IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ水平Figure 6 Contents of IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γin colon of juvenile mice in each group

表6 各组幼鼠结肠细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ水平变化Table 6 Contents of IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γin colon of juvenile mice in each group（）／（pg·mL-1）

表6 各组幼鼠结肠细胞因子IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ水平变化Table 6 Contents of IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γin colon of juvenile mice in each group（）／（pg·mL-1）

1）与模型组比较，P＜0.05；
2）与模型组比较，P＜0.01；
3）与益生菌组比较，P＜0.011）Compared with model group，P＜0.05；
2）Compared with model group，P＜0.01；
3）Compared with C.butyricum group，P＜0.01

2.5 参苓白术散对幼鼠结肠PLZF蛋白表达的影响

随机选择空白组、参苓白术散高剂量组、益生菌组及模型组各5个样本，检测调控iNKT细胞分化的关键转录因子——早幼粒白血病锌指蛋白（PLZF）表达水平。与空白组比较，模型组的PLZF蛋白表达水平增高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。参苓白术散高剂量组的PLZF蛋白表达水平高于模型组，但无统计学差异（P＞0.05）。益生菌组的PLZF蛋白表达水平低于模型组，但无统计学差异（P＞0.05），如图7所示。

图7 各组幼鼠结肠PLZF蛋白表达Figure 7 The expression of PLZF in colon of juvenile mice in each group

AC因主要累及直肠和乙状结肠，又称食物蛋白诱发的过敏性直结肠炎（food protein-induced allergic proctocolitis，FPIAP）。AC多见于母乳喂养儿，因母亲摄入可疑致敏食物，含有过敏源的乳汁被患儿吸收到消化道，发生异常的免疫反应而导致过敏症状［13］。随着配方奶粉在婴幼儿喂养中的广泛应用，牛奶蛋白或大豆蛋白过敏导致过敏性肠道疾病发生的患儿数量亦有增多的趋势。牛奶作为婴幼儿主要的食物来源，也是常见的过敏源［14］。由于迄今尚无非入侵性、特异性强的诊断方法，临床容易漏诊、误诊AC，也使得回避可疑致敏食物的防治方法难以实现。AC被认为是一种非IgE介导的食物过敏反应［15］，发病可能与肠道微生物-黏膜免疫失调［16-18］、口服耐受被打破［19］、婴幼儿肠道机械屏障发育不成熟［20］、嗜酸性粒细胞浸润结肠黏膜［21］、食物因素及某些遗传易感因素有关，但其确切的病理生理机制目前尚未明确。

噁唑酮是一种经典的半抗原，可与正常肠道菌群产生的糖脂类大分子结合成为完全抗原，用其灌肠能诱导小鼠发生结肠炎，出现体质量损失、腹泻、便血等类似于儿童AC的临床表现，而且恢复快，有自愈性特点［22］，与AC由接触食物源性致敏物质而发病、一旦停止接触致敏原则可快速痊愈的特点非常相似。因此用噁唑酮诱导法建立幼年小鼠的过敏性结肠炎模型，符合本实验探索中医药早期干预是否能有效防治儿童AC的研究目的。有动物研究表明，噁唑酮诱导的结肠炎模型中，IL-4分泌增多，而IFN-γ减少［23］。Heller等［24］则指出，IL-13也是噁唑酮诱导性结肠炎的重要病理因素，但其被IL-13的中和性抗体（IL-13Rα2-Fc）中和后，小鼠不会发生结肠炎症。另有研究发现，恒定自然杀伤性T细胞（iNKT细胞）相关缺陷的小鼠不发生结肠炎，而iNKT细胞能在α-半乳糖神经酰胺（一种已被证实能激活CD1d依赖型iNKT细胞的糖脂类抗原）的刺激下产生IL-13，介导肠道炎症反应［24］。

根据本实验的DAI及HPS评分等结果，参苓白术散的早期干预并无法有效减轻AC幼鼠的过敏性炎症反应，减少IL-4、IL-13等促炎细胞因子的分泌。对此我们考虑以下因素，由于既往尚未见有生育期前幼鼠灌肠恶唑酮致敏的实验研究，本次灌肠所采用的1%噁唑酮溶液，虽可使幼鼠结肠出现炎症反应，与对成年小鼠进行的相关研究类似，但病理学检查却未见明显嗜酸性粒细胞浸润，其结肠IL-4、IL-13水平较之空白组增高亦不显著，说明本实验所建立的幼鼠AC模型与成年小鼠模型相比存在一定差异。另一方面，对低日龄幼鼠执行灌肠操作的难度较大，若按既往文献所述采用导尿管，发现无论何种型号，均无法成功插入到结肠部位。在改用内径适中的PE导管后，虽最终成功地将灌肠液送至结肠部位，但其硬度高，对低日龄幼鼠肠壁的刺激性强，因此会降低幼鼠对高浓度药物的耐受性，进而影响实验结果。与此相对应的是，虽然既往研究发现酪酸梭菌等益生菌的治疗能显著改善噁唑酮诱导的成年AC小鼠的结肠炎症反应［25］；
但本次实验结果表明，酪酸梭菌的早期干预也未能使AC幼鼠的结肠炎症得到显著改善，并减少IL-4、IL-13的表达。另外，本研究发现高剂量参苓白术散早期干预的幼鼠，其结肠IL-10、IFN-γ含量显著增高，而这两个细胞因子能有效抑制过敏性炎症反应。此外，为验证噁唑酮诱导的幼鼠结肠炎模型及药物干预作用是否与iNKT细胞相关，本实验还选取iNKT细胞分化过程中的关键转录因子PLZF进行检测。结果表明各组间的PLZF表达水平未出现明显差异，提示iNKT细胞可能与此无明显相关性。此外，还需要指出的是，本实验中幼鼠的生存率仅36.7%，既往研究表明，使用噁唑酮诱导法造模的死亡率即使在成年鼠中亦普遍很高，有学者统计其平均为35%～40%，甚至也有高达65%者，其可能原因为黏膜丧失、体温过低和全身性炎症（涉及血清和脾脏）等［26］，由于幼鼠尚未发育成熟，对药物和侵入性操作的耐受性可能更差。

综上所述，虽然本研究未能在动物实验层面证实参苓白术散早期干预对防治儿童AC的有效性，但其对IL-10、IFN-γ等抑炎症因子的影响，提示中医药仍可能存在抑制炎症的积极作用，但本研究并未明确其具体机制。这提示在今后的工作中，需进一步改进研究设计，进一步优化动物模型复制方法，以利于深入探讨儿童AC发病及中医药防治的相关机制。

作者贡献声明

叶丽妍、曾丽盈：设计实验，进行实验研究，统计分析数据，撰写论文；
陈佩文、叶绮娜、赖东兰：参与部分实验研究；
陈晓刚：提出研究思路和框架，修改论文。

利益冲突声明

本研究受到国家自然科学基金项目（81674021）资助，不存在任何潜在利益冲突。