甲芪肝纤颗粒中桃仁的定性定量方法研究

叶惠煊 李 敏 黄 胜 冷建宏 颜冬兰

九芝堂股份有限公司，湖南 长沙 410205

九芝堂股份有限公司生产的独家中成药品种“甲芪肝纤颗粒”[标准号：WS3-737（Z-203）-2006（Z）-2007]由黄芪、防己、茯苓等11 味中药材组成，具有疏肝活血、健脾祛湿的功效。临床上用于乙型肝炎肝纤维化透明质酸、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白等血清学指标异常属肝郁血瘀兼脾虚湿滞者，症见胁肋疼痛，肝脾肿大，脘腹胀满，神疲乏力，纳差，便溏，舌质紫暗或有瘀斑，舌苔腻等病症的治疗[1-2]。桃仁为本品处方中的臣药，苦杏仁苷是其有效成分[3-5]，现代药理学研究表明其具有神经保护[6]、抗纤维化[7]、抗肿瘤[8]等作用。

本品现行质量标准中，已有防己、延胡索、厚朴、牛膝、莪术和黄芪的质控方法，同时也有学者建立了该品种黄芪甲苷的含量测定方法[9]，但未建立桃仁的相关质控项目，临床上存在一定的用药安全隐患，十分有必要建立相应的质控方法。薄层色谱法和高效液相色谱法是目前较为常规的检测方法，已广泛运用于中药、中成药的质量控制[10-13]。因此，本研究开展制剂中桃仁的定性定量方法研究，具体包括如下两方面内容：①以苦杏仁苷对照品和桃仁对照药材作为对照，利用薄层色谱法建立桃仁的定性质控方法；
②以苦杏仁苷对照品作为对照，利用高效液相色谱法建立处方中桃仁的定量质控方法，同时检测了15 批次大生产样品的数据，结合苦杏仁苷含量转移率，拟订制剂的含量限度。为该品种后续整体质量标准提升以及其他含桃仁中药制剂的质量控制奠定基础。

1.1 仪器

高效液相色谱仪（日本岛津公司，型号：2030C）；
电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司，型号：DZKW）；
数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-700DV）；
十万分之一电子天平（瑞士梅特勒托利多公司，型号：MS205DU）；
电子分析天平（日本岛津公司，型号：ATX224）；
薄层层析板（德国默克公司，型号：硅胶G）。

1.2 试药

桃仁（山桃仁）对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：120953-200705），苦杏仁苷（中国食品药品检定研究院，批号：110820-201305，纯度85.8%；
中国食品药品检定研究院，批号：110820-202109），甲芪肝纤颗粒（九芝堂股份有限公司，国药准字Z20030056），甲醇的级别为色谱纯，水的级别为超纯水，其他试剂的级别为分析纯。本研究中所使用的饮片及辅料，均符合《中华人民共和国药典》的质量要求[14]。

2.1 薄层鉴别方法研究[15]

2.1.1 色谱条件 采用硅胶G 薄层板，以体积比为15 ∶40 ∶30 ∶10 的三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水的混合溶液，于10℃以下放置12 h 后分取下层液作为展开溶剂，展开后取出薄层板，自然挥干溶液，然后用香草醛硫酸溶液（5 g →100 ml）喷洒均匀，放置烘箱中（温度为105℃）加热，直至目标斑点显色为止，取出进行检视。

2.1.2 苦杏仁苷对照品溶液的配制 取苦杏仁苷对照品，加适量甲醇溶解后，摇匀，制成苦杏仁苷对照品溶液（浓度为2 mg/ml），放置于冰箱备用。

2.1.3 桃仁对照药材溶液的制备 称取桃仁对照药材约1 g，加50 ml 纯化水加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣再加甲醇1 ml 复溶，作为对照药材溶液，放置于冰箱备用。

2.1.4 供试品溶液的制备 取甲芪肝纤颗粒约5 g，称定，粉碎，加甲醇15 ml 并超声处理20 min，滤过，滤液回收溶剂至干，残渣加5 ml 温水溶解后放置至室温，采用大孔吸附树脂柱（型号为D101 型，内径为1.5 cm，长度为8 cm），加20 ml水洗脱，弃去水液，用氨试液（4 →100）30 ml 洗脱，弃去氨液，再量取10 ml 纯化水洗脱，水液弃去，再用浓度为20%的乙醇30 ml 进行洗脱，回收洗脱液至干，残渣再加l ml甲醇复溶，即得。

2.1.5 阴性对照样品溶液的制备 除桃仁外，取甲芪肝纤颗粒处方中其他药味，按照质量标准制成阴性对照样品。取阴性对照样品约5 g，称定，研细，照2.1.4项下供试品溶液制备方法制成阴性对照样品溶液。

2.1.6 实验结果 取3 批样品（批号分别为20201216、20201217 和20201218），按照2.1.4 项下方法，分别制备相应的供试品溶液。依次精密吸取供试品溶液和阴性对照样品溶液各5 μl、苦杏仁苷对照品溶液和桃仁对照药材溶液各10 μl，按确定的色谱条件进行实验，结果见图1。在供试品的薄层色谱中，呈现出与苦杏仁苷对照品和桃仁对照药材薄层色谱相同颜色的目标斑点，且阴性对照样品无干扰。

图1 桃仁的TLC 鉴别

2.2 含量测定方法研究[14，16]

2.2.1 色谱条件 采用色谱柱SHIMADZU C18-120（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相为甲醇-水溶液（20 ∶80），等度洗脱；
检测波长为210 nm，柱温为35℃，流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl。

2.2.2 对照品溶液的配制 取苦杏仁苷对照品适量，精密称定后加适量甲醇溶解并摇匀，制成对照品储备溶液（浓度为0.56 mg/ml）。精密吸取上述对照品储备溶液10 ml，加甲醇稀释5 倍后摇匀，制成的对照品溶液（浓度为0.11 mg/ml），放置于冰箱备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 取批号为20201216 的样品，粉碎，精密称取约1.0 g，置于锥形瓶中，精密量取并加入25 ml 的50%甲醇，称重，采用超声波提取法（功率为700 W，频率为40 kHz）提取45 min，取上清液，用微孔滤膜（规格为0.45 μm）滤过，取续滤液，得供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取阴性对照样品约1.0 g，精密称定，按照2.2.3 项下供试品溶液的制备方法，制成阴性对照溶液。

2.2.5 线性关系、检测限和定量限的考察 取2.2.2项下的对照品储备溶液，得对照品溶液①。取溶液①30 ml 转移至50 ml 的棕色量瓶中，加适量甲醇稀释至刻度，摇匀，得溶液②，取对照品溶液②40 ml 转移至50 ml 的棕色量瓶中，加适量甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液③，取溶液③30 ml 转移至50 ml的棕色量瓶中，加适量甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液④，取溶液④20 ml 转移至50 ml 的棕色量瓶中，加适量甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液⑤，取溶液⑤10 ml 转移至50 ml 的棕色量瓶中，加适量甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液⑥。精密吸取上述6 种对照品溶液各10 μl，依次测定，以苦杏仁苷对照品的峰面积y为纵坐标、浓度x为横坐标，将检测结果通过线性回归计算后绘制相应的标准曲线，并计算得到回归方程：y=7940x+19343，R2=1。结果表明，苦杏仁苷在6.46 ～560.45 μg/ml 范围内呈线性关系。按照3 倍和10 倍的信噪比分别考察检测限和定量限，结果分别为1.29 μg 和4.48 μg。

2.2.6 专属性考察 取供试品溶液、对照品溶液以及阴性对照溶液，按确定的色谱条件依次进样，记录色谱图（图2）。将阴性对照溶液与供试品溶液的色谱图相比较，结果在苦杏仁苷色谱峰的相应保留时间上无色谱峰，表明该方法专属性好。

图2 HPLC 图

2.2.7 精密度考察 精密吸取供试品溶液10 μl，进样6 次，测得的苦杏仁苷色谱峰面积的相对标准偏差值为0.62%，说明高效液相色谱仪精密度良好。

2.2.8 稳定性考察 取供试品溶液，精密吸取10 μl，分 别 在0、2、4、6、8、12 和24 h 依 次 进 样。结果供试品溶液中苦杏仁苷色谱峰面积的相对标准偏差值为2.30%，表明其在24 h 内检测稳定。

2.2.9 重复性考察 取批号为20201216 的甲芪肝纤颗粒样品，粉碎，平行制备6 份供试品溶液，依次进样，结果苦杏仁苷色谱峰面积的相对标准偏差值为1.94%，表明已建立的方法重复性较好。

2.2.10 加样回收率考察 取批号为20201216 的甲芪肝纤颗粒样品（苦杏仁苷含量5.8185 mg/g），粉碎，精密称取0.5 g，分别加入苦杏仁苷对照品2.94 mg，平行制备6 份供试品溶液，依次进样测定，通过计算得苦杏仁苷的平均回收率为97.91%，RSD值为1.04%。见表1。

表1 苦杏仁苷加样回收结果（n=6）

2.2.11 耐用性考察 为确定已建立的含量测定方法的耐用程度是否良好，故选择3 个型号的色谱柱进行考察。结果在使用不同型号色谱柱的条件下，样品均能够准确定量，表明方法耐用性较好。见表2。

表2 方法耐用性考察结果表（n=2）

2.2.12 含量测定 取15 批次甲芪肝纤颗粒样品，分别制备供试品溶液，每批次样品分别平行制备2 份，依次进样测定，同时采用外标法计算本品中桃仁的苦杏仁苷含量，具体结果见表3。

表3 15批次甲芪肝纤颗粒的含量测定结果表（n=2）

根据表3 结果可知，15 批甲芪肝纤颗粒中苦杏仁苷含量平均值为6.77 mg/g，药材→成品的平均转移率为50.87%。根据2020 年版《中华人民共和国药典》一部[14]桃仁项下苦杏仁苷含量的最低限度为2.0%，同时考虑到苦杏仁苷在大生产过程中的损失的情况，按苦杏仁苷在本品中的转移率以不低于40%计算，故暂定本品中含桃仁以苦杏仁苷（C20H27NO11）含量计算为3.36 mg/g。

3.1 TLC前处理优化

TLC 前处理方法参考了2020 年版《中华人民共和国药典》一部[14]桃仁项下的鉴别方法，但目标斑点拖尾不清晰，影响结果判断。而采用D101 型大孔吸附树脂柱进行除杂，则斑点明显，重复性良好，故采用其作为TLC 前处理的方法。

3.2 TLC展开剂考察

采用三氯甲烷- 乙酸乙酯- 甲醇- 水系统 进 行 展 开，分 别 考 察（15 ∶40 ∶22 ∶10）和（15 ∶40 ∶30 ∶10）比 例 在10 ℃以 下放置12 h 的下层溶液为展开剂，结果表明（15 ∶40 ∶30 ∶10）的比例较优，目标斑点Rf 值适中，方法重复性良好，故采用其作为TLC 展开系统。

3.3 HPLC前处理条件优化

在建立桃仁中苦杏仁苷的HPLC 含量测定方法时，对样品前处理条件开展了单因素考察实验，结果在采用超声法提取45 min、使用50%的甲醇作为提取溶剂的条件下，样品中的苦杏仁苷色谱峰响应值较好，定量准确，作为HPLC 前处理条件较为合适。

本研究较为系统的开展了甲芪肝纤颗粒中桃仁的定性定量质控方法研究，结果显示该方法重复性好、重现性佳，为甲芪肝纤颗粒质量标准的全面提升奠定了一定的基础。同时，该质控方法的建立，对处方中含有桃仁的中药、中成药的质量研究也提供了一定的参考依据。