甘麦龙骨汤对慢性睡眠剥夺大鼠神经递质、激素水平的影响

孙 麒，何建珉，王俊安，魏君萍，周 奕，王国华

(1上海中医药大学附属曙光医院·上海 200021；
2上海交通大学医学院附属第九人民医院黄浦分院·上海 200011；
3上海中医药大学附属市中医医院·上海 200071)

甘麦龙骨汤系全国名老中医王翘楚经验方，在临床上广泛用于各类失眠症的治疗，疗效显著[1-2]。全国名老中医王翘楚教授系上海市中医医院专家委员会主任委员，上海中医药大学终身教授，上海市中医医院中医睡眠学科奠基人、学术带头人。王老毕生致力于中医睡眠疾病的理论创新、临床及实验研究。甘麦龙骨汤系王老以《伤寒论》经方柴胡加龙骨牡蛎汤为基础，结合临床经验化裁所得[3]。目前该方已在临床上被广泛运用，收效甚佳。从现代生物学角度探讨其潜在的作用机制，有助于对该经验方更深入的理解及其临床推广应用。为了进一步明确该方剂改善睡眠的可能作用机制，本文通过动物实验观察其对对慢性睡眠剥夺大鼠神经递质及激素水平的影响。报道如下。

1.1 动物 健康雄性SD大鼠44 只，SPF级，4周龄，体质量180～220 g，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部；
实验动物生产许可证编号：SCXK(沪)2018-0006。实验前常规饲养5 d,分笼饲养，每个笼内4只大鼠，室温维持在22～26 ℃，相对湿度55%～65%，昼夜循环，保持12 h光照，大鼠灌胃、添加饲料及换水等均由上海市中医医院动物实验中心专人负责。

1.2 药物及试剂 甘麦龙骨汤由上海市中医医院制备，药方为：淮小麦27 g、甘草9 g、苦参9 g、蝉衣6 g、僵蚕9 g、明天麻9 g、嫩钩藤15 g(后入)、葛根27 g、川芎12 g、软柴胡9 g、煅龙骨27 g、广郁金9 g、石菖蒲9 g、焦山栀9 g、黄芩12 g、赤白芍各12 g、紫丹参30 g、合欢皮27 g、夜交藤30 g。制备方法：首先用8倍于药材的清水浸泡15 min，武火煮沸后改文火煎15 min，取出药液；
药渣中加入6倍水量同法煎熬，取药液；
将两次药液混合煎熬，浓缩为990 mL(相当于1.8 g生药/mL),灭菌后分装于4 ℃保存备用。大鼠前列腺素D2(PGD2)、5羟色胺(5-HT)、促甲状腺激素(TSH)、去甲肾上腺素(NE)、皮质酮/肾上腺酮(CORT)ELISA试剂盒均购自上海科博瑞生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 Thermo Fresco-17离心机；
Bio-Rad 680 酶标仪；
MMM-group恒温培养箱；
eppendorf移液器。

2.1 实验动物分组、给药及造模 适应性饲养5 d后，用EXCEL中随机数字发生器将44只大鼠随机分入4 组，包括正常对照组、中药组、模型组及模型+中药组，每组11只。正常对照组及模型组接受0.9%氯化钠注射液灌胃；
中药组及模型+中药组接受甘麦龙骨汤灌胃，给药比重为18 g/kg。4组大鼠均在每日上午9∶00接受灌胃给药1次，连续10 d。中药组1只大鼠灌胃时呛入气管死亡。慢性睡眠剥夺大鼠模型构建采用改良多平台水环境法[4]。睡眠剥夺箱(30 cm×30 cm×150 cm)内中央放置11个直径6 cm、高8 cm的平台，平台间隔15 cm。箱内注水，使水面在平台下约1cm，水温维持在(20±2)℃；
将实验大鼠放在箱内平台上，持续日光灯照射，自由摄食饮水，当大鼠进入睡眠REM阶段时因触水而惊醒，导致睡眠剥夺，每日睡眠剥夺时长18 h(中午 12∶00 至次晨6∶00)，持续8周。对照为大平台，直径12 cm，大鼠在平台上能够进入睡眠。4 组大鼠中，仅对模型组及模型+中药组大鼠进行造模。造模时间为72 h，从给药第7天开始。

2.2 观察指标及测定方法

2.2.1 行为学评价 采用Y-迷宫实验评价实验动物的行为学表现。正式开始实验前，将大鼠放入迷宫中先适应3～5 min，采用随机不休息法，无规则次序变换安全区，对大鼠所在支臂与另一支臂通电，动物在电击下逃窜至灯光区后再保持10 s或30 s为一次测试。然后动物所在支臂为下次测试的起始位置进行下一次测试。观察指标：①错误反应次数：每个实验日进行20次训练测试，一个实验日完成所有反应中错误反应的次数。②主动回避率：大鼠在灯亮后但未通电的5 s内完成逃避反应的次数占总反应次数的百分率。安全区灯亮，电刺激尚未开始时，大鼠即逃往安全区说明明暗辨别条件反射(即主动回避反应)形成[4]。

2.2.2 脑脊液和血清PGD2及血清5-HT、TSH、NE、CORT含量测定 动物行为学实验结束后立即采集实验动物的脑脊液及血标本。用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，采用直视下划破硬脊膜抽取大鼠脑脊液约100 μL，置于液氮中冷冻保存备用。采用ELISA法测定脑脊液中PGD2的浓度，按照试剂盒说明书进行操作。取完脑脊液后，迅速腹腔静脉取血4 mL，冰浴静置0.5 h，然后在4 ℃环境中3 000 r/min离心10 min，分离血清，-80 ℃保存备用，采用ELISA法测定血清PGD2、5-HT、TSH、NE、CORT的含量，按照试剂盒说明书进行操作。正常对照组1只大鼠血标本溶血，模型+中药组1只大鼠抽取脑脊液失败。

3.1 各组大鼠Y迷宫实验结果 见表1。

表1 各组大鼠Y迷宫实验结果比较

3.2 各组大鼠脑脊液和血清PGD2含量的比较 结果见表2。

表2 各组大鼠脑脊液及血清PGD2水平比较

3.3 各组大鼠血清5-HT、NE、TSH及CORT含量的比较 结果见表3。

表3 各组大鼠血清5-HT、NE、TSH及CORT含量比较

根据“心主神明”理论，古代医家论治失眠多“从心辨治”；
而王翘楚教授另辟蹊径，首倡“从肝论治失眠”理论，认为现代人失眠多伴“情志问题”(情绪过激或心情不畅)，因“肝气被郁”故而发为失眠；
因此当结合现代人的身心特点从肝论治失眠[3]，甘麦龙骨汤系“从肝论治失眠”理论下的临床经验总结。甘麦龙骨汤方中淮小麦、甘草、苦参具有除烦安神、开郁散结之效；
蝉衣、僵蚕可息风止痉、镇静安神；
柴胡疏肝解郁；
龙骨、牡蛎平肝潜阳、镇静安神；
天麻、钩藤平抑肝阳；
葛根、川芎活血解肌、祛风止痛；
郁金、菖蒲解郁开窍安神；
焦山栀、黄芩清肝经湿热、泻火除烦；
赤、白芍活血柔肝配合丹参活血安神；
合欢皮有昼开夜合之特性，能安五脏、和心志，令人欢乐无忧；
夜交藤亦养心安神。诸药相合，理气疏肝、行气解郁、除烦安神，共奏促眠之功[5]。

本研究通过建立慢性睡眠剥夺大鼠模型，客观评价了名老中医经验方甘麦龙骨汤对大鼠血清神经递质及激素水平的影响。在本研究中，通过行为学评价可观察到模型组大鼠错误次数明显增多，主动回避率明显减少，说明睡眠剥夺损害了大鼠的学习、记忆和空间认知等能力；
而与之相比，模型+中药组的错误次数明显减少，主动回避率明显增多，说明给予中药后，可以减轻睡眠剥夺对大鼠学习、记忆和空间认知等能力的损害。

已有研究指出，PGD2是目前已知最有潜力的内源性促睡眠物质之一，鼠脑脊液中PGD2浓度与睡眠-觉醒周期一致，呈现节律性改变，并且随睡眠剥夺期间嗜睡倾向增加而增加[6-7]。5-HT能神经元在中枢神经系统广泛存在，研究显示调节睡眠/觉醒的药物中发现多数药物是通过5-HT受体的不同亚型发挥作用[8-9]，因此对5-HT神经元及其受体特性的深入研究对推进临床上与睡眠/觉醒调节障碍相关疾病的治疗可能有重要意义。NE神经元在调节睡眠/觉醒过程中也发挥着重要作用，MALLICK等[10]研究发现，睡眠剥夺会影响海马体区NE水平，短时间会导致其浓度增加而长时间则会降低浓度，表明海马体内NE水平对睡眠高度敏感且时间不同影响不一[11]。TSH和CORT也是参与睡眠调节的重要的内源性物质，其分泌过程具有脉冲节律性特点，并受多种因素的影响，其分泌紊乱可导致睡眠/觉醒障碍[12-13]。为了探寻甘麦龙骨汤减轻睡眠剥夺造成脑功能损害的可能机制，本研究检测了脑脊液及血液中上述几种与睡眠功能密切相关的神经递质和激素。结果显示，经慢性睡眠剥夺后，大鼠脑脊液、血清PGD2水平及血清5-HT、NE、TSH和CORT水平均显著升高；
而与之相比，通过中药灌胃后，上述异常升高的指标则明显下降。因此，笔者推断甘麦龙骨汤的促眠机制可能与此相关。

综上所述，甘麦龙骨汤可减轻慢性睡眠剥夺对大鼠神经功能的损害，其机制可能是通过下调脑脊液及外周血清PGD2及血清5-HT、TSH、NE水平实现的。