C/EBPβ,对心房肌细胞KCNQ1基因表达的调控作用研究

胡莎莎 应永军 卢瑛

心房颤动（下称房颤）是最常见的心律失常，全球患者约有3 350 多万，并且随着人口老龄化，房颤的发病率逐年增高[1]。目前房颤的治疗主要包括抗凝、控制心室率以及复律三个方面，但由于房颤的发病机制尚未完全阐明，不管是药物复律还是导管消融，房颤的复发率仍然较高[2]。目前研究发现，多种离子通道异常可导致房颤的发生增加。KCNQ1 是国内鉴定的第1 个与房颤有关的离子通道编码基因，其功能的增强型突变（S-140G）可诱导Iks电流增强，导致家族性房颤的发生[3]。目前，KCNQ1 功能增强型突变被认为与房颤密切相关，但有关KCNQ1 的转录调控模式报道较少。本研究通过筛选KCNQ1 的转录因子，探讨其与房颤的关系，为房颤治疗提供新靶点，现报道如下。

1.1 主要材料 转录因子筛选板购自美国Signosis公司（批号：FA-1001），染色质免疫沉淀试剂盒购自美国CST 公司（批号：56383），RPMI 1640、B27、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast grouth factor，bFGF）购自美国Thermofisher 公司（批号：31870082、17504044、PHG0360），activin A、Noggin、维甲酸（retinoic acid，RA）购自美国Sigma 公司（批号：GF300、GF173、R2625），Dickkopf 相关蛋白1（dickkopf-related protein 1，DKK1）购自美国R&D 公司（批号：5439-DK），KCNQ1、CCAAT/ 增 强 子 结 合 蛋 白β（CCAAT/enhancer binding protein beta，C/EBPβ）抗体、骨成型蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）购自美国Abcam 公司（批号：ab84819、ab32358、ab87063）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 从Ensembl 数据库（www.ensembl.org）下载人KCNQ1 启动子序列，启动子序列定义为KCNQ1 基因第1 个外显子前面的2 000bp 序列。将此序列输入Promo3 数据库（http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）进行检索。

1.2.2 转录因子筛选板筛选 转录因子筛选采用转录因子筛选板（美国Signosis 公司）进行。具体操作如下：合成上述KCNQ1 启动子片段。提取心房肌细胞核蛋白，将核蛋白、转录因子探针及启动子片段混合孵育，孵育结束后，分离游离探针与转录因子+启动子复合物，随后将结合于转录因子上的结合探针洗脱，采用微孔板杂交，在化学发光仪上检测结合于转录因子上的探针，结果以相对光单位表示。由于启动子片段可与转录因子探针竞争性结合转录因子，若某转录因子可与KCNQ1 启动子结合，则该转录因子与相应的探针结合就减弱，相对光单位减少，心肌细胞提取物相对光单位/（心肌细胞提取物+KCNQ1 启动子片段组相对光单位）升高。

1.2.3 细胞培养 采用Zhang 等[4]报道的方法，将人胚胎干细胞诱导分化成心房肌细胞。具体操作如下：首先使用RPMI 1640 和B27 对人胚胎干细胞H7 进行培养，第1 天加入BMP4 25 ng/mL 和bFGF 6 ng/mL，第2 天加入activin A 100 ng/mL，第4、5 天加入Noggin 250 ng/mL，第6~8 天加入RA 1 μm，第6~11天加入DKK1 200 ng/mL。在第14 天，使用免疫荧光检测分化效率。

1.2.4 心房肌细胞体外快速起搏 采用美国Ion Optix 公司系统进行心房肌细胞快速起搏（快速起搏组），将待处理心房肌细胞接种于6 孔细胞培养板，插入刺激电极进行快速电刺激，刺激参数：电压18 V，频率5 Hz，脉宽4 ms，刺激时间6 h；
对照组则不进行起搏。

1.2.5 慢病毒包装及细胞感染 将C/EBPβ 编码基因构建至PLVX-IRES-ZSGREEN1 载体，得到用于过表达C/EBPβ的慢病毒穿梭载体。在网站http://crispr-era.stanford.edu/ 设计靶向C/EBPβ 启动子区sgRNA 序列，得到评分最高的序列为：GAAAACGCGCTCCGGGTGCC。将上述序列构建至载体PLV hUbC-Cas9-KRAB T2A GFP 中，得到C/EBP 抑制表达的慢病毒穿梭载体。使用上述两种穿梭载体，结合慢病毒包装载体pspax2 和pmd2.g，共同转染HEK293T 细胞，得到慢病毒，使用纯化试剂盒对慢病毒进行纯化，并测定慢病毒滴度。使用得到的慢病毒，用感染复数10 感染心房肌细胞，荧光显微镜下观察感染效率，分别选取C/EBPβ抑制表达、慢病毒感染效率50%以上的心房肌细胞和过表达C/EBPβ、慢病毒感染效率50%以上的心房肌细胞作为C/EBP β抑制组、过表达组。另选用一组心房肌细胞不插入任何慢病毒穿梭载体作为对照组。

1.2.6 KCNQ1 mRNA 表达检测 采用染色质免疫沉淀法（chromatin immunoprecipition，Chip）[5]，试剂盒购自美国CST 公司（批号：56383）。使用多聚甲醛对心房肌细胞进行固定，核酸酶对染色质进行消化。再使用蛋白A/G 琼脂糖珠对样本进行洗涤，加入C/EBPβ 抗体或IgG 抗体进行孵育。孵育完成后，加入5 M 氯化钠和蛋白酶K 并加热对样本进行解交联，沉淀下来的DNA 进行过柱纯化。纯化产物进行PCR 扩增后电泳。引物序列如下，上游引物：TTTGCTAATGGTGCTTCT；
下游引物：GGCTCAAGTGTAAAGGGT。

1.2.7 KCNQ1 启动子结合表达 采用荧光定量PCR 检测。抽提细胞总RNA，随后进行逆转录，逆转录完成后进行荧光定量PCR，通过Ct 值计算快速起搏组和对照组的相对表达量。所用的引物序列如下，上游引物：GCGTCTCCATCTACAGCACG；
下游引物：GAAGTGGTAAACGAAGCATTTCC。

1.2.8 KCNQ1、C/EBPβ 表达检测 采用蛋白质印迹法。抽提细胞蛋白，然后进行电泳和转膜，一抗孵育过夜，使用HRP 标记二抗进行孵育，最后采用ECL 显影。一抗浓度为KCNQ1 1∶1 000，C/EBPβ 1∶1 000。

1.2.9 Iks电流测定 在倒置显微镜下，找到慢病毒感染后带荧光的细胞，操纵玻璃电极微操纵器将记录电极接触到细胞，然后给予负压作用，促进细胞形成GΩ 封接。形成GΩ 封接后，进行快速电容补偿，然后持续给予负压作用，吸破细胞膜，形成全细胞记录模式。在全细胞记录模式下，进行慢速电容补偿并记录膜电容及串联电阻的数值。细胞Iks的电压刺激方案如下：保持电压-80 mV，予-40~+60 mV、步阶电压为10 mV、时长4 000 ms 的去极化脉冲，随后复极至-40 mV，记录2 000 ms，回到钳制电位。记录各个电压下的电流，计算电流密度。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；
计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 KCNQ1 的转录因子筛选结果 生物信息分析发现KCNQ1 启动子上存在多个C/EBPβ 的结合位点。筛选试验发现，C/EBPβ、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）和YY1 转录因子可与KCNQ1 启动子片段相结合，其中C/EBPβ 与KCNQ1 启动子片段的结合能力最强。见图1（插页）。

2.2 快速起搏组与对照组中KCNQ1 mRNA、KCNQ1、C/EBPβ、C/EBPβ 与KCNQ1 启动子片段结合表达的比较 快速起搏组和对照组中KCNQ1 mRNA 表达分别为3.11±0.85 和1.02±0.25，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，快速起搏组KCNQ1 和C/EBPβ 蛋白水平均上调，C/EBP 与KCNQ1 启动子片段结合显著增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。

2.3 C/EBPβ 抑制组、过表达组与对照组中KCNQ1 mRNA 表达水平比较 对照组和C/EBPβ 过表达组KCNQ1 mRNA 表达水平分别为1.03±0.31 和2.68±0.55，而对照组与C/EBPβ 抑制组KCNQ1 mRNA 表达水平分别为1.02±0.22 和0.21±0.05，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

图2 快速起搏组与对照组中KCNQ1 mRNA、KCNQ1、C/EBPβ 及C/EBPβ 与KCNQ1 启动子片段结合表达的比较（a：快速起搏组与对照组KCNQ1 mRNA 表达比较，*P＜0.05；
b:对照组与快速起搏组KCNQ1 蛋白印记表达图；
c：对照组与快速起搏组C/EBPβ 蛋白印记表达图；
d：对照组与快速起搏组C/EBPβ 和KCNQ1 启动子片段结合比较）

2.4 C/EBPβ 抑制组、过表达组与对照组Iks电流水平比较 与对照组比较，C/EBPβ 过表达组Iks膜电位上调，而C/EBPβ 抑制组Iks膜电位下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。在+60 mV 电压下，对照组、C/EBPβ 抑制组和过表达组的电流峰值分别为（7.40±2.20）、（4.91±1.45）和（8.78±2.09）pA/pF，与对照组比较，C/EBPβ 过表达组电流峰值水平升高，而C/EBPβ 抑制组电流峰值水平降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

房颤是临床常见的心律失常之一，可导致脑卒中、血栓栓塞、心力衰竭、心肌梗死等，降低患者的生活质量[6]。在目前的治疗水平下，房颤的致死率和致残率仍然较高。近年来房颤的遗传学研究已经取得了较大进展，但是有关房颤发生机制方面的研究仍有不足。KCNQ1 是第一个被报道与房颤发生有关的离子通道编码基因，其增强突变可引起家族性房颤的发生。因此，KCNQ1 的转录调控机制可能为房颤的治疗提供一个潜在靶点。

KCNQ1 位于人类染色体11p15.5，长约400 kb，由17 个外显子构成。其编码的KvLQT1 主要在心肌内表达[7]。KCNQ1 基因突变将导致心脏缓慢激活K+通道的功能丧失,诱发房颤。本研究发现，在快速起搏心房肌细胞中KCNQ1 表达明显高于对照组，证实KCNQ1 与房颤密切相关。C/EBPβ 可转录许多炎症因子，导致炎症增强[8]。有研究认为，房颤与心房炎症密切相关[9-13]。本研究发现，KCNQ1 启动子片段上有多个C/EBPβ 结合位点。因此，笔者推测C/EBPβ 可能通过转录调控KCNQ1 导致Iks增强，进一步导致心房肌组织有效不应期的缩短，诱导房颤发生。

图3 C/EBPβ 抑制组、过表达组与对照组中KCNQ1 mRNA 和蛋白表达（a：C/EBPβ 过表达组和对照组中KCNQ1 mRNA 蛋白表达比较及电泳图；
与对照组比较，*P＜0.05；
b：C/EBPβ 抑制组和对照组中KCNQ1 mRNA 蛋白表达比较及电泳图；
与对照组比较，*P＜0.05）

图4 C/EBPβ 抑制组、过表达组与对照组Iks 膜电位、电流峰值的电流密度比较（a：C/EBPβ抑制组、过表达组和对照组Iks 膜电位水平；
b：在+60 mV 电压下对照组、C/EBPβ 抑制组和过表达组的电流峰值水平比较，与对照组比较，*P＜0.05）

本研究通过染色质免疫沉淀实验发现，快速起搏心房肌细胞中C/EBPβ、KCNQ1 mRNA 和蛋白水平及C/EBP 与KCNQ1 启动子结合显著高于对照组，说明C/EBPβ 和KCNQ1 参与了房颤的发生。实验进一步对C/EBPβ 抑制组、C/EBPβ 过表达组和对照组进行分析，发现C/EBPβ 过表达组KCNQ1 mRNA、蛋白表达水平及Iks电流明显高于对照组，而C/EBPβ 抑制组KCNQ1 mRNA、蛋白表达水平及Iks电流明显低于对照组，说明C/EBPβ 与KCNQ1 启动子结合可增强KCNQ1 表达，促进Iks增大。

综上所述，本研究发现心房肌细胞快速起搏时C/EBPβ 表达升高，C/EBPβ 与KCNQ1 启动子结合增强，诱导KCNQ1 的转录增加，引起Iks增加。因而，C/EBPβ 可作为一个房颤治疗的潜在靶点。但本研究局限于细胞实验，未进行动物实验，其结果是否符合动物或人体的病理生理过程尚需进一步研究。