基因多态性对儿童肾病综合征糖皮质激素治疗效果的影响

黄佳斯 何宇婷 陈瑶 余学高 黄浩 陈培松★

原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是儿童期常见病之一，在儿童中发病率约为2～7/100 000，男女比例为2∶1，以水肿、低蛋白血症、大量蛋白尿和血尿为主要临床特征［1］。糖皮质激素是目前治疗PNS 的首选药物，但临床上PNS 患儿对其应答存在个体差异，约有10%～20%儿童在常规糖皮质激素治疗8 周后不能得到临床缓解或复发后再次使用无效，即糖皮质激素耐药型肾病（glucocorticoid-resistant nephrotic syndrome，SRNS），50%～70% SRNS 在5～10年内进展为终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）［2］。多种因素可导致SRNS，如遗传及免疫因素、合并感染、高凝、肾静脉血栓、伴肾小管间质损伤以及激素受体或耐药基因表达异常［3-4］。文献报道，CYP3A4*18B、CYP3A5、ABCB1、NR1I2、MIF等5 个基因编码的蛋白通过参与糖皮质激素的代谢、转运或调节等多种途径影响血清中糖皮质激素的水平或功能［5-8］。而蛋白的水平及活性基本由相关基因多态性决定。本研究采用序列特异引物引导的聚合酶链反应（polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP）检测PNS 患儿5 个相关基因多态性，旨在探究CYP3A4*18B、CYP3A5、ABCB1、NR1I2、MIF基因多态性对PNS 患儿糖皮质激素疗效的影响。

1.1 一般资料

选取2019年7月至2020年6月中山大学附属第一医院儿科就诊的PNS 患儿58 例，符合肾病综合征的诊断标准：24 h 尿蛋白＞3.5 g/d，血清蛋白＜30 g/L。排除标准：①所有继发型肾病综合征患者；
②恶性肿瘤患者，包括各种血液病和实体瘤；
③资料不全，未明确糖皮质激素敏感型患者。其中男43 例，女15 例，年龄1～12 岁。依据患儿对口服泼尼松治疗反应可分为糖皮质激素敏感组（glucocorticoid-sensitive，SS）和糖皮质激素耐药组（glucocorticoid-resistant，SR）。见表1。PNS 的诊断标准及糖皮质激素治疗反应类型参照中华医学会儿科学分会肾脏病学组指定的儿童常见肾脏疾病诊治循证指南［9］。患者在入院时签署了泛知情同意临床剩余样本用于科研。2～12 岁儿童由家长监护人代签。本研究经医院医学伦理委员会批准［批件号：（快）-KY-2021EC-003］。

表1 58 例肾病综合征患儿一般资料（±s）Table 1 Demographic data of 58 children with nephrotic syndrome（±s）

表1 58 例肾病综合征患儿一般资料（±s）Table 1 Demographic data of 58 children with nephrotic syndrome（±s）

特征例数（例）性别（例）男女始发年龄（岁）病理检查（例）微小病变型肾病局灶节段性肾小球硬化膜性肾病系膜增生性肾小球肾炎糖皮质激素敏感组29 23 6 4.02±2.97 11 7103糖皮质激素耐药组29 20 9 4.82±2.82 23 12 632

1.2 仪器与试剂

PCR 热循环仪（ABI7500）；
凝胶成像系统（SAGECREATION）；
DNA 提取试剂盒（德 国QIAGEN 公司）；
免疫抑制剂相关基因分型检测试剂盒（天津市秀鹏生物技术开发有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA 提取

采集2 mL 2%EDTA-K2抗凝外周静脉血；
采用德国QIAGEN 全血基因组DNA 提取试剂盒按照说明书进行DNA 提取，采用超微量分光光度计检测DNA 的纯度及浓度，调整浓度为30～50 ng/μL，A260/A280 值为1.6～2.0。保存于-20℃冰箱待测。

1.3.2 PCR-SSP

采用ABI7500PCR 热循环仪进行PCR；
采用天津市秀鹏生物技术开发有限公司的免疫抑制剂相关基因分型检测试剂盒（PCR-SSP 法）进行检测，操作流程严格按照操作说明书进行，并严防污染。

1.3.3 凝胶电泳及成像

配置2.5%琼脂糖凝胶，将6 μL PCR 反应产物转移至凝胶孔中，140 V 电压下电泳10 min，应用UVP 凝胶成像系统记录结果，并进行结果判读。

1.4 统计分析

采用SPSS 20.0 对研究数据进行分析和处理；
计数资料n（%）表示，采用χ2检验；
P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 PNS 患儿糖皮质激素敏感组和糖皮质激素耐药组CYP3A4*18B（G20230A）基因型及等位基因分布频率比较

糖皮质激素敏感组和糖皮质激素耐药组CYP3A4*18B（G20230A）基因型及等位基因分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 耐药组和敏感组间CYP3A4*18B（G20230A）基因型和等位基因分布频率比较［n（%）］Table 2 Comparison of CYP3A4*18B（G20230A）genotype and allele distribution frequency between resistant group and sensitive group［n（%）］

2.2 PNS 患儿糖皮质激素敏感组和糖皮质激素耐药组CYP3A5（A6986G）基因型及等位基因分布频率比较

糖皮质激素敏感组和糖皮质激素耐药组CYP3A5（A6986G）基因型及等位基因分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 耐药组和敏感组间CYP3A5（A6986G）基因型和等位基因分布频率比较［n（%）］Table 3 Comparison of CYP3A5（A6986G）genotype and allele distribution frequency between resistant group and sensitive group［n（%）］

2.3 PNS患儿糖皮质激素敏感组和糖皮质激素耐药组ABCB1（C3435T）基因型及等位基因分布频率比较

糖皮质激素敏感组和糖皮质激素耐药组ABCB1（C3435T）基因型分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
两组等位基因分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 耐药组和敏感组间ABCB1（C3435T）基因型和等位基因分布频率的比较［n（%）］Table 4 Comparison of ABCB1（C3435T）genotype and allele distribution frequency between resistant group and sensitive group［n（%）］

2.4 PNS 患儿糖皮质激素敏感组和糖皮质激素耐药组NR1I2（A7635G）基因型及等位基因分布频率比较

糖皮质激素敏感组和糖皮质激素耐药组NR1I2（A7635G）基因型及等位基因分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 耐药组和敏感组间NR1I2（A7635G）基因型和等位基因分布频率比较［n（%）］Table 5 Comparison of NR1I2（A7635G）genotype and allele distribution frequency between resistant group and sensitive group［n（%）］

2.5 PNS 患儿糖皮质激素敏感组和糖皮质激素耐药组MIF（G-173C）基因型及等位基因分布频率的比较

糖皮质激素敏感组和糖皮质激素耐药组MIF（G-173C）基因型及等位基因分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6。

表6 耐药组和敏感组间MIF（G-173C）基因型和等位基因分布频率比较［n（%）］Table 6 Comparison of MIF（G-173C）genotype and allele distribution frequency between resistant group and sensitive group［n（%）］

CYP3A4 与CYP3A5 是CYP3A 家族的重要成员，CYP3A 酶通过脱氢和羟基化作用，代谢地塞米松、布地奈德等多种糖皮质激素。不同个体基因的单个碱基序列差异所导致的CYP3A 酶单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），可能导致糖皮质激素类药物在体内代谢存在个体差异。CYP3A4*18B（G20230A）是目前CYP3A4基因出现频率最高的SNP，该突变能提高CYP3A4酶的活性［10］。CYP3A5（A6986G）是CYP3A5基因中最常见的SNP，该突变导致mRNA 出现新的剪切位点，使得蛋白质翻译在102 位氨基酸处中断，蛋白质功能降低，对糖皮质激素的代谢功能受阻［5］。本文对糖皮质激素耐药患儿与糖皮质激素敏感患儿CYP3A4*18B（G20230A）、CYP3A5（A6986G）位点基因型和等位基因进行了分析，发现两组间差异无统计学意义。

ABCB1基因编码P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），也称为多药耐药蛋白（multidrug resistance protein ，MDR），是转运蛋白超家族的成员之一，P-gp 可将细胞内药物泵出细胞外，使胞内药物浓度降低而产生耐药，ABCB1基因变异可影响P-gp的表达水平或活性，导致糖皮质激素代谢发生个体差异［6］。目前已发现ABCB1多个SNP 位点与糖皮质激素代谢相关，其中第26 号外显子C3435T备受关注，其可通过影响RNA 的稳定性来降低mRNA 水平，或者通过影响蛋白质翻译折叠而改变P-糖蛋白与药物的相互作用［11］。本文对ABCB1（C3435T）的3 种基因型及2 个等位基因进行了分析，结果显示ABCB1（C3435T）与PNS 患儿糖皮质激素治疗效果无关。国外学者Safan 等［12］在研究80 例糖皮质激素敏感患儿和40 例糖皮质激素耐药患儿后发现ABCB1（C3435T）与PNS 患儿糖皮质激素疗效无关。印度学者Jafar 等［13］也得出了同样结论，均与本文的结果相一致。

人类NR1I2基因编码孕烷X 受体（pregnane X receptor，PXR），是配体激活依赖的孤核受体，能与多种底物相互作用，调控下游靶基因的转录表达，包括Ⅰ相代谢酶如CYP3A4、Ⅱ相代谢酶UGTs 与磺基转移酶、药物泵出转运蛋白如P-gp 等［7］。糖皮质激素作为P-gp 及CYP3A4 的作用底物，其体内代谢过程很可能受NR1I2SNP 影响。一项日本研究表明，NR1I2（G7635A）可能影响肾移植术后患者的泼尼松血药浓度［14］。但本研究发现NR1I2（7635A＞G）与PNS 患儿的糖皮质激素治疗效果不相关。

人类MIF基因编码的巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibilitory factor，MIF）在机体免疫系统起重要调控作用。MIF 作为促炎细胞因子，能够抑制巨噬细胞的游走，促进巨噬细胞在炎症局部聚集、增生，激活及分泌一些细胞因子，从而发挥抗激素作用［8］。研究发现，SRNS 患儿血浆MIF 浓度显著高于糖皮质激素敏感者，是糖皮质激素治疗效果的良好预测指标［15］。MIF（-173G＞C）位于MIF基因启动子区域，调控MIF基因转录及表达。Ramayani 等［16］对120 例PNS 患儿进行研究发现SRNS 患儿的循环血清MIF 水平升高，MIF-173C等位基因频率显著升高。但本研究结果显示糖皮质激素耐药组与糖皮质激素敏感组的MIF（-173G＞C）基因型与基因频率比较，差异均无统计学意义。

综上所述，CYP3A4*18B（G20230A）、CYP3A5（A6986G）、ABCB1（C3435T）、NR1I2（A7635G）、MIF（G-173C）的基因多态性可能与中国PNS 患儿糖皮质激素治疗效果不相关。