罕见B(A)亚型的鉴定及家系分析

刘建成

宁夏回族自治区血液中心血型参比实验室,宁夏银川 750011

ABO血型是发现和确定的人类第一个血型系统，其抗原性和免疫原性最强，能够引起严重的溶血性输血反应、新生儿溶血症等疾病。目前，通常采用免疫血清学方法来鉴定ABO血型，但在实际工作中经常会遇到正反定型不相符或者凝集反应较弱的情况，这是因为除了正常的ABO血型之外还存在一些ABO亚型[1-2]。正确地鉴定ABO血型至关重要，B(A)亚型便是一种较为稀有的亚型，在血型鉴定时除了免疫血清学方法之外还需要通过基因分型的方法才能正确鉴定其血型，它在我国北方的献血者中频率为1/(5～10)万[3]。

1.1标本来源 先证者来自于健康的献血者，符合献血标准。经过知情同意随后采集了先证者父亲和母亲的血液标本。

1.2试剂与仪器 正定型抗-A、抗-B，反定型A细胞、B细胞(上海血液生物医药有限责任公司)；
ABO血型基因分型试剂盒(天津秀鹏公司)；
全血基因组DNA提取试剂盒(天根生物公司)；
DNA 聚合酶(大连TaKaRa)；
测序引物(上海生工公司合成)以上所有试剂均在有效期内；
PCR扩增仪(ABI Veriti DX)；
凝胶成像仪(SYNGENE G:BOX)；
Nanodrop One超微量分光光度计(基因有限公司)；
3730测序仪(美国ABI公司)。

1.3免疫血清学方法 ABO正反定型检测按照《全国临床检验操作规程》和参照文献[4]进行。

1.4基因分型方法

1.4.1全血基因组DNA提取 按照试剂盒说明书操作，DNA浓度和纯度经超微量分光光度计测定，最终浓度稀释为50 ng/μL。

1.4.2PCR-SSP检测 按照天津秀鹏PCR-SSP扩增说明书进行操作，扩增程序见表1。内参质控为人类生长激素基因的保守片段。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。

表1 PCR-SSP程序

1.4.3ABO基因测序 扩增ABO基因第6、7外显子进行测序。反应体系为30 μL，其中DNA模板3 μL，Taq酶(10 mmol/L)0.3 μL，10×缓冲液3 μL，dNTP(10 mmol/L)4 μL，测序引物(10 μmol/L)3 μL，ddH2O 16.7 μL。扩增反应程序见表2，上下游引物序列见表3，PCR产物纯化后直接进行测序。

表2 第6、7外显子 PCR扩增反应程序

表3 第6、7外显子扩增引物序列

1.4.4序列分析 利用软件DNAMAN分析测序结果，与GenBank中的序列进行比对。

2.1血型血清学结果 先证者血型呈现正反定型不一致，正定型与抗-A和抗-B均有凝集，抗-A为弱凝集1+，与抗-H反应强凝集。反定型只与A细胞呈现凝集，血清学表型为AwB。先证者和家系成员血型反应格局结果见表4。

表4 先证者及家系成员ABO血型反应格局

2.2ABO血型基因分型结果 通过PCR-SSP检测发现先证者基因型为B/O，先证者父亲基因型为A/O，先证者母亲基因型为B/O。结合血型血清学结果先证者父亲基因型和血清学结果一致为正常的A型。先证者和其母亲的基因型和血清学结果不一致，进一步通过测序发现先证者和母亲的B基因均发生了700C>G点突变，与GenBank中的序列进行比对，参照红细胞抗原突变数据库ABO等位基因的命名，先证者和母亲ABO等位基因为B(A)02，为杂合子。

截至目前，共发现 43个血型系统，400多个抗原[5-6]。ABO血型一般指A、B、O、AB 4种血型。ABO亚型是在这4种血型基础上进一步细分而命名的血型，具有遗传基础和免疫血清学特点，由于疾病等无法遗传的原因导致的血型改变不能称为亚型，有些虽然基因发生改变但是不影响免疫血清学特点的血型也不是亚型[7-8]。至今已经发现有60多种A亚型和30多种B亚型，A亚型有A1、A2、A3、Ax等，B亚型比A亚型少见，有B2、B3、Bx、B(A)等[9]。

ABO亚型抗原的结构、性质以及数量与正常的ABO血型抗原存在一定差异，主要是由于基因突变、糖基转移酶的活性、底物等原因造成的[10-11]。

B(A)亚型在ABO亚型中发生率非常低，在基因水平上被认为是B型，在细胞水平上表达了正常的B抗原和较弱的A抗原[12]。B(A)亚型的血清学特点是正定型红细胞与抗-B和抗-H凝集强度较强，与抗-A凝集较弱或者不凝集，反定型血清中含有较强的抗-A抗体[13-14]。本文中先证者和其母亲的免疫血清学结果初步判定为AwB亚型，经基因分型鉴定为B(A)亚型。1985年，B(A)亚型最早被发现，有学者阐释了B(A)亚型的发生机制，发现了第一个能够编码正常的B糖基转移酶且该酶同时具有A糖基转移酶的活性的等位基因，命名为B(A)01[15]。至今，共发现6种B(A)等位基因，分别为B(A)01、B(A)02、B(A)03、B(A)04、B(A)05、B(A)06[15]。与常见的B101基因序列相比，B(A)等位基因存在1～2个碱基的点突变，这些突变影响了编码B糖基转移酶的3个氨基酸的翻译，导致B糖基转移酶同时具有了A糖基转移酶的活性。在我国，最常见的等位基因是B(A)02和B(A)04[16]。本文中先证者和其母亲的B(A)亚型表型是由B(A)02等位基因引起的，与通常的B101基因碱基序列比对，B(A)02等位基因发生了一个nt700C>G 点突变，导致编码翻译的α-1,3-半乳糖转移酶除了能够合成B抗原之外还能合成少量的A抗原。先证者的父亲为正常的A型，母亲为B(A)亚型，说明先证者的B(A)02等位基因遗传于其母亲。

在鉴定ABO血型的时候，由于免疫血清学的局限性，ABO亚型的鉴定存在一定的困难，非常容易将B(A)亚型误判为AwB型，对输血造成了一定的风险，所以发现ABO血型正反不符时可以进一步利用基因分型的方法准确鉴定血型，保证安全、有效地输血治疗。B(A)亚型的献血者可以加入稀有血型库进行保留，捐献的血液可以制备成冰冻红细胞进行保存。若患者为B(A)亚型需要输血时，很难找到同型血液，可以输注O型或B型洗涤红细胞，也可以采取自体输血进行治疗。