基于网络药理学及数据挖掘探讨持续性房颤中药用药规律

段城林，袁果真，寿鑫甜，陈婷，朱雪萍，杜宜航，胡元会

心房颤动（房颤，AF）临床中常见的心律失常之一，指规律而有序的心房电活动丧失，而以快速无序的颤动波为表现，可由如高血压、冠心病等器质性心脏病诱发，房颤发病率高，易引发心力衰竭和动脉栓塞，严重影响人类健康[1]。临床中常将房颤分为五大类：首诊房颤（首次确诊）、阵发性房颤（持续时间≤7 d）、持续性房颤（持续时间＞7 d）、长期持续性房颤（持续时间≥1年）、永久性房颤（持续＞1年）。其中持续性房颤在一般人群的发生率在1%～2%，随着人口老龄化程度不断加重，持续性房颤的发生率有可能达到2%～4%[2]。

根据持续性房颤的临床表现和起病特点，中医辨病为“心悸怔忡病”。近年来中医药治疗持续性房颤的研究日益增多，已有相关文献报道中药复方或某种中药有效活性成分对持续性房颤的治疗作用，参松养心胶囊、稳心颗粒治疗持续性房颤是临床常用的有效中成药制剂[3,4]。然而，不同处方、药物对持续性房颤的研究，难以系统性发现中药对持续性房颤的组方规律。本研究通过网络药理学研究，以治疗持续性房颤的相关疾病靶点为切入点，通过靶靶点-化合物-中药活性成分-中药-用药规律的思路，对获取的中药进行数据挖掘，统计归经、四气五味，以期为中医药治疗持续性房颤的中药新药研发、临床用药规律等提供一些参考。

1.1 收集相关靶点的获取及GO、KEGG分析在DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/search） 和GeneCards数据库（https://www.genecards.org）检索持续性房颤相关靶点。应用Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）在线绘图平台，将在两数据库获得的疾病靶点绘制Venn图，重复靶点保留二分之一。将获取的疾病靶点应用UniProt数据库（https://www.uniprot.org）查询相关靶点全称并将其进行ID注释。将所得的持续性房颤的潜在靶点采用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov）进行细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）、生物过程（biological process）三个部分注释分析；
KEGG数据库是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的数据库，旨在揭示生命现象的遗传与化学蓝图，利用图形介绍众多的代谢途径以及各途径间的关系，运用KEGG数据库（https://www.kegg.jp）对筛选得到的相关靶点进行通路富集分析。

1.2 筛选相关化合物和靶点-化合物网络构建根据上述所收集相关潜在靶点，借助T C M S P（https://tcmspw.com/tcmsp.php）数据库搜索潜在靶点相关化合物，并以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、类药性（drug-likeness，DL）过滤靶点，OB（oral bioavailability，OB）是指制剂中药物被吸收进入人体循环的速度和程度，类药性（drug-likeness，DL）为化合物与已知药物的相似性，用于评估化合物可能存在的导致失败的特性。以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，筛选持续性房颤潜在靶点相关化合物。应用Cytoscape3.8.2建立靶点-化合物可视化网络。

1.3 收集相关中药，构建靶点-化合物-中药网络据已收集的化合物成分，通过TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）获取包含所得化合物的相关中药，在靶点-化合物可视化网络的基础上，应用Cytoscape3.8.2可视化软件建立靶点-化合物-中药网络。应用Cytoscape3.8.2中CytoHubba进行各网络节点的度值分析，并且通过度值（degree）分析找出关键节点，初步分析中药及化合物对持续性房颤的干预强度。

1.4 中药药性、归经分析由上述所搜集的中药以中国药典2020版[5]和中药学第九版[6]为标准进行中药药名规范和四气五味、归经等进行收集和整理。符合条件的中药进行药性、药味、药物归经等进行统计分析。

2.1 持续性房颤相关靶点获取及靶点GO、KEGG分析DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/search）以“persistent atrial fibrillation”为检索关键词，获得持续性房颤相关靶点156个；
GeneCards数据库以“persistent atrial fibrillation”为检索词，总计获得1804个相关靶点，根据数据库对靶点—疾病的相关性评分（Relevance score），筛选评分前10%（Relevance score＞16.1）的靶点作为持续性房颤的潜在靶点，总计180个靶点与持续性房颤相关性较高。如图1所示，去除两数据库中重复出现的28个靶点，共获取308个靶点。获取的308个潜在靶点通过TCMSP数据库在“target name”一栏中以各潜在靶点单个单词进行检索。靶点筛选条件：①在TCMSP平台靶点可匹配化合物；
②化合物OB≥30%，DL≥0.18。获取相关靶点后，以靶点为搜索对象，获取靶点相关的化合物，通过TCMSP数据库中“chemical name”，将化合物名称逐个填入，化合物需满足上述条件，最终纳入研究的核心靶点总计21个，靶点具体信息见表1。

表1 靶点具体信息表

图1 疾病靶点Venn图

应用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov）进行GO富集分析，包括细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物过程（biological process）。结果①如图2所示，主要参与的生物过程是：DNA结合转录因子活性的调节（regulation of DNA-binding transcription factor activity）、对肽激素的反应（response to peptide hormone）、肌肉细胞增殖（muscle cell proliferation）、DNA结合转录因子活性的正调控（positive regulation of DNA-binding transcription factor activity）、细胞对肽的反应（cellular response to peptide）等；
②如图3可知，富集分子功能主要在：受体配体活性（receptor ligand activity）、细胞因子活性（cytokine activity）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、生长因子活性（growth factor activity）、磷酸酶结合（phosphatase binding）等；
③图4可得，潜在靶点细胞定位集中于：膜筏（membrane raft）、膜微区（membrane microdomain）、膜区（membrane region）等。

图2 生物过程富集分析图

图3 分子功能富集分析图

图4 细胞组分富集分析图

本文应用KEGG数据库对持续性房颤的相关靶点进行通路分析，如图5散点图所示，气泡越大代表所富集基因数越多，P值大小表示相关性大小，相关靶点主要参与的通路包括：糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症中的蛋白聚糖、FoxO信号通路、疟疾、HIF-1信号通路等通路。

图5 靶点参与通路图

2.2 构建靶点-化合物网络以TCMSP数据库为依据搜索相关靶点及其相关化合物，结果总计获得566个相关符合筛选条件的化合物。将获取的靶点-化合物表格导入Cytoscape构建靶点-化合物网络，并进行可视化分析，详见图6。由图可知，网络由566个节点，480条边构成，倒三角红色图形为持续性房颤相关靶点，而蓝色方框为相关靶点的化合物。利用Cytoscape中CytoHubba插件，对相关化合物进行度值测算，度值大小代表网络中连接线的多少，度值越高与相关靶点联系密切性越高。本文展示度值排序在前20的化合物。由表2可知度值前6位的化合物分别为槲皮素（quercetin）、表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate]、木犀草素（luteolin）、非瑟酮（fisetin）、汉黄芩素（wogonin）、鸢尾酮（irisolidone），这6个化合物与持续性房颤靶点联系密切，可能为治疗持续性房颤的主要小分子物质。通过网络可视化分析，度值排前5位的靶点分别是：钾电压门控通道亚家族H成员2（Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily H Member 2）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor）、肿瘤蛋白P53（Tumor Protein P53）、白介素-6（Interleukin -6），度值分别为263、210、20、13、12，预测这5个可为潜在靶点而发挥作用，相较于其他潜在靶点更具干预作用。

图6 靶点-化合物网络

表2 化合物度值表

2.3 靶点-化合物-中药可视化网络根据上述所述，总计获得满足条件的相关化合物（related ingredients）566个。根据所得化合物在TCMSP数据库进行检索，获取相关中药，总计获得4613个相关中药，去除重复者得到363味中药。进一步根据《中国药典》2020版和中药学第九版对中药药名进行规范，如“白毛夏枯草”规范为“白头翁”等。对363味中药经过筛选，发现47味中药并未在药典和中药学书中记载，如花生衣、玳玳花、白药子、八角莲、了哥王根等中药，去除这部分中药，最终得到316味中药。将最终得到的21个相关靶标，566个化合物，4129个中药，应用Cytoscape软件进行网络可视化分析，构建所得的网络共847个节点，13 839条边。利用Cytoscape软件中的CytoHubba插件对所得847个节点进行度值排序，对前100的节点进行网络分析，如图7所示。对当前网络进行分析，度值前5的中药如下：甘草（188）、延胡索（110）、钩藤（100）、连翘（72）、白果（70）。同时中药-靶点关联度分析，中药所含靶点数越多，说明中药调节持续性房颤可能作用越强，根据上述分析，白果（20）、枇杷叶（19）、余甘子（19）、甘草（16）四味中药包含靶点最多，预测在治疗持续性房颤中有重要作用。

图7 靶点-化合物-中药度值前100

2.4 中药药性、归经统计分析由上述分析可知，可能对持续性房颤具有潜在治疗作用的中药总计有316味，应用《中国药典》及《中药学》获取药物的四气五味信息。如图8所示，预测治疗持续性房颤的中药中以苦味药为著，其余依次排序为辛、甘、酸、咸。

如图9可知，寒性药为占比最高治疗持续性房颤的中药，占比可达38%。如柱形图10可知，除心经外，所得中药归经排序依次为肝经（163）、肺经（129）、胃经（101）、脾经（89）、肾经（78）、大肠（53）、膀胱（24）、胆（22）、小肠（13）、心包（5）、三焦（2）。因此，从归经分析，治疗持续性房颤的中药中肝经最多，其次为肺经。

图8 中药五味分布

图9 中药四气分布

图10 中药归经分布

持续性房颤的治疗原则以积极治疗原发疾病和诱发因素，并在此基础上，积极预防血栓栓塞、转复并维持窦性心律及控制心室率。持续性房颤治疗方法不外乎药物复律、电复律、射频消融术三种治疗方法，治疗药物的选择多为IA类、IC类、Ⅲ类，药物复律仍为现今主要治疗手段。然而，奎尼丁可引发致命性心动过速，导致晕厥增加死亡率，因此现今很少使用[7]。IC类药物的使用令室性心律失常的发生率提高，严重性器质性心脏病患者适用性较低，胺碘酮为现今维持窦性心律的主要药物[8]。因此西药对于持续性房颤的治疗局限性较大，可供选择的药物较少。

中药的复杂化合物组成在其治疗过程中优势突出，与西药单靶点治疗截然不同，有着靶点多，副作用小，耐药性少，来源广等优势[9]。中医药现代化研究经过多年的发展，研究发现传统中药在治疗持续性房颤的作用，如三七总皂苷缩短由Ba Cl2、Ca Cl2-Ach和乌头碱混合液所引起的大鼠心律失常的时间，减少房颤发生的次数；
甘松新酮可能通过作用于cAMP-PKA细胞信号转导通路；
关白附能有效抑制房颤持续时间，延长心房ERP，保护心房Cx40表达，改善房颤引起的电重构；
甘草次酸、异甘草素、延胡索乙素可有效抗心律失常[10-14]。但中药复方具有多成分、多靶点的特点，致使中药复方中有效成分的作用机制研究一直难以得到有效突破。与此同时，将传统中药有效复方中单味中药进行逐一验证，不仅效率低下、准确性、可控性较低，因此研究实施的困难程度较高。网络药理学基于系统生物学、多向药理学的理论，结合生物信息学、数据挖掘、计算机技术等多学科知识[15]，通过分子网络分析，推动新药的研发效率，降低新药的研发成本[16]。并且网络药理学的整体性和系统性特点与中医整体观、辨证论治原则上具有一致性[17]。本研究通过网络药理学研究方法，以疾病靶点-化合物-中药为研究思路，应用疾病靶点、化合物、中药等多个相关数据库，以网络拓扑学分析的方法，逐次匹配出治疗持续性房颤的中药。在此基础上，应用统计分析、数据挖掘技术对中药进行分析，以期通过本方法预测治疗持续性房颤的中药用药规律，进一步指导临床用药和新药研发。

通过靶点-化合物网络研究可知，槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、木犀草素、非瑟酮、汉黄芩素、鸢尾酮等6种化合物与持续性房颤的相关靶点较多。房颤的发病机理现今研究表明与K+外流减少、Ca2+超负荷、氧化应激损伤、心房纤维化、全身炎症有关[18-23]。非瑟酮、槲皮素是天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗增殖的作用[18-20]。研究结果表明，持续性房颤外向钾离子电流减少，槲皮素通过浓度依赖的方式槲皮素优先结合并激活WThKv1.5通道可有效治疗持续性房颤，非瑟酮可能通过调节AMPK/ NF-kB、p65和p38MAPK/Smad3信号通路，改善心房炎症、纤维化从而降低持续性房颤发生率、易感性[20,21]。表没食子儿茶素没食子酸酯具有抑制钙离子、钙调蛋白或cGMP依赖性蛋白激酶直接调节Ca2+稳态，减少炎症因子的分泌，拮抗氧化等特性，对持续性房颤的发生发展有着一定的抑制作用[22,23]。本研究所获取中药活性成分对治疗持续性房颤的新药研发可提供一些参考。KEGG通路富集分析发现，治疗持续性房颤潜在靶点的可能作用通路主要有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症中的蛋白聚糖、FoxO信号通路、疟疾、HIF-1信号通路等。研究表明小鼠予DUB泛素末端水解酶1抑制剂作用于HIF-1信号通路，显著减少血管紧张素Ⅱ诱发的左心房纤维化、炎细胞浸润，从而降低房颤的发生率[24]。

靶点-化合物-中药网络结果显示，甘草、延胡索、钩藤、连翘、白果五味中药预测在治疗持续性房颤中可能作用较强。《伤寒论》言：“伤寒，脉结代，心动悸，炙甘草汤主之”，方中以甘草为君定悸为千百年诸多医家实践验证，现代研究亦表明甘草总黄酮、甘草次酸、异甘草素等甘草有效活性成分在持续性房颤中的作用[11,25]。钩藤，味甘性凉，归肝、心包经，止惊安悸，药理学研究结果得出钩藤碱能抑制外向K+和抑制延迟整流K+，调控K+通道，同时还可阻滞钙离子通道，达到干预持续性房颤的效果[26]。延胡索具有抗心律失常、扩张冠状动脉增加血流量、改善心肌缺血等作用，含有多种生物碱类及蒽醌类化合物，对于抗心律失常，主要为延胡索生物碱类化合物，其中延胡索乙素通过抑制钙离子通道，阻滞钾离子外流方面降低包括持续性房颤等多种心律失常[27]。网络分析所得中药在持续性房颤中的治疗具有确切证据，而后付诸临床实践，仍需大量动物及临床试验以佐证其安全性、有效性。上述研究可为传统治疗持续性房颤组方提供参考，提高临床疗效。

根据统计分析结果可知，治疗持续性房颤的中药四气五味预测中味苦性寒占比最高。中医将持续性房颤归为“心悸怔忡”一类疾病之中，结合房颤的临床表现及发病特点，中国中医药学会中医诊断专业委员会将房颤定名为“心动悸”[28]，房颤基本病机可分为虚实两类，标实可见虚、火、痰、瘀等，如李杲《兰室秘藏》中所载：“心神烦乱怔忡，是胸中气乱有热，皆因膈上伏火蒸蒸然不安”。《素问·宣明五气篇》载：“酸入肝、苦入心、甘入脾、辛入肺、咸入肾”，苦味能泄、能燥、能坚，具有清热泻火之功，寒凉之药可制约阳热之证，，苦寒之品与心动悸之火热证型相符，清膈上之伏火，安心神，止动悸，直折里热。从中药归经分析结果可知，除心经药物外，入肝经之药最多。李平教授从多年临证经验得出凡属颤动、瞤动等症状大抵为风象，故有从“心风”辨治房颤，认为房颤由内风、外风扰动而致[29]。段文慧、杨湖等亦主张房颤为风象，将房颤的发作归于风邪袭扰，诸风可致房颤的发生[30,31]。肝为风木之脏，与风气相通，诸风归于肝，风属阳，主动。因此，入肝经之药对于持续性房颤的治疗具有一定意义，调肝可祛风，风气动自除。

综上所述，本研究采用网络药理学的方法，对从中药-化合物-靶点的思路进行逆向思考，以靶点-化合物-中药网络构建探讨持续性房颤的用药预测。同时采用数据挖掘技术，对所取得的数据进行分析，获得对治疗持续性房颤有一定意义的用药规律，对于新药的研发和探索提供一些借鉴。本研究仍有局限性，数据库未及时更新相关数据，所获取的信息时效性较差。所预测的结果未得到动物实验或临床试验的有效性检验，因此有效性需要进一步借助相关研究深入探讨。