术前血清miR-135b、miR-141水平对结直肠癌根治术后预后的评估价值分析

赖箭波

结直肠癌在全世界范围内的发病率和死亡率位居恶性肿瘤前列，而近年来随着人民饮食结构等生活方式的改变，其在我国的发病率及死亡率均处于上升阶段［1］。目前，结直肠癌根治术仍是临床首选的治疗手段。但根据全球肿瘤调查报告数据，每年仍有超过88 万结直肠癌患者死亡，约占癌症死亡例数的10%，预后效果仍未达预期［2］。因此，为进一步优化结直肠癌患者的诊疗措施，寻找行结直肠癌根治术患者的潜在预后因子的临床意义深远。miRNA 作为一类长度为18～25 个核苷酸的内源性非编码单链RNA，可在转录后通过特异性调控靶基因表达，从而参与机体的多种生理及病理过程［3］。研究表明［4］，miRNA 的异常表达与肿瘤的发生、发展，侵袭及转移有关，提示检测肿瘤患者的血清miRNA 水平可能有助于疾病的早期诊断与预后评估。Zhang 等［5］研究发现，循环血miR-135b 在结直肠癌患者中的表达明显高于健康者；
Ardila 等［6］也指出，血清miR-141 在结直肠癌组织中的含量显著升高。本研究旨在探讨术前血清miR-135b、miR-141 水平对结直肠癌根治术后预后的评估价值，以期为临床运用提供依据。报道如下。

1.1 一般资料

以2018年1月至2019年4月于深圳市人民医院胃肠外科行结直肠癌根治术的106 例结直肠癌患者为研究组。纳入标准：①均经术后病理组织学诊断证实为结直肠癌；
②均行结直肠癌根治术治疗，且术前未接受化疗等其他抗肿瘤治疗者；
③均有记录完整的病例资料及随访记录。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；
②为继发性结直肠癌；
③存在梗阻、穿孔而行急诊手术者；
④合并血液系统疾病者。其中男性65 例，女性41 例；
年龄平均（61.37±7.85）岁；
淋巴结转移：有60 例，无46例；
TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期36 例，Ⅲ～Ⅳ期70 例；
分化程度：低分化42 例，中、高分化64 例；
肿瘤位置：结肠50 例，直肠56 例。另选同期于本院行健康体检的100 名体检者为对照组，研究组和对照组的年龄、性别等基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），有可比性。本研究经院医学伦理委员会批准通过，受试者或家属已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-135b、miR-141 检测

收集研究组所有患者和对照组术前1 周的空腹静脉血5 mL，在离心半径10 cm、转速1 000 r/min 下离心10 min，取上层血清，置于-80℃储存待测。采用购自美国赛默飞公司的miRNA 提取试剂盒、miRNA 逆转录试剂盒，严格按照说明书进行操作，提取血清中的总miRNA 并逆转录成cDNA，并采用实时荧光定量PCR 法检测血清miR-135b、miR-141 水平。PCR 反应体系为25，内参为GAPDH，反应条件为预变性95℃10 min；
变性95℃15 s；
退火60℃1 min；
共40 个循环。结果取3 个样本复孔的均值。血清miR-135b、miR-141 表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。

1.2.2 临床资料收集

收集研究组所有患者的相关临床资料，包括患者的性别、年龄、是否合并高血压、是否合并糖尿病、有无淋巴结转移、TNM 分期、分化程度、肿瘤位置、肿瘤直径等。

1.2.3 随访

研究组患者术后至少随访3年，采用电话、微信和门诊方式进行随访，术后1年每3 个月随访1次，2年以后每间隔6 个月随访一次。本研究中末次随访截止日期为2022年4月30日。总生存时间（overall survival，OS）定义为从手术结束至患者因任何原因引起的死亡或末次随访的时间，无病生存期（disease-free survival，DFS）定义为从手术结束至患者出现肿瘤复发或转移或因疾病进展导致死亡的时间。

1.3 统计学方法

应用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，行t检验；
计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。采用受试者工作特征曲线（ROC）来确定血清miR-135b、miR-141 对OS 的最佳界值；
并以Cox风险比例模型分析影响患者生存预后的影响因素。以Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并以Log-Rank法进行组间生存差异检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 研究组和对照组术前血清miR-135b、miR-141比较

研究组结直肠癌患者术前血清miR-135b、miR-141 表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 研究组和对照组术前血清miR-135b、miR-141比较（±s）Table 1 ComparisonofserummiR-135bandmiR-141between study group and control group before operation（±s）

表1 研究组和对照组术前血清miR-135b、miR-141比较（±s）Table 1 ComparisonofserummiR-135bandmiR-141between study group and control group before operation（±s）

组织研究组对照组t 值P 值n 106 100 miR-135b 1.90±0.54 0.98±0.42 13.564＜0.001 miR-141 1.03±0.36 0.82±0.31 4.475＜0.001

2.2 术前血清miR-135b、miR-141 的最佳界点

本研究共纳入106 例结直肠癌患者，术后3年OS 生存率为79.25%（84/106），术后3年DFS 生存率为73.58%（78/106）。以OS 为状态变量，术前血清miR-135b、miR-141 的最佳界值分别为2.215、1.120。见表2、图1。

表2 术前血清miR-135b、miR-141 对OS 的诊断价值Table 2 Preoperative diagnostic value of serum miR-135b and miR-141 for OS

图1 ROC 曲线Figure 1 ROC curve

2.3 术前血清miR-135b、miR-141与临床特征的关系

根据血清miR-135b、miR-141 的最佳界值，把所有患者分为miR-135b≥2.215 组、miR-135b＜2.215组和miR-141≥1.120 组、miR-141＜1.120 组，术前血清miR-135b、miR-141 均与患者的TNM 分期、分化程度、淋巴结转移有关（均P＜0.05）。见表3。

表3 术前血清miR-135b、miR-141 与临床特征的关系［n（%）］Table 3 Relationship between serum miR-135b and miR-141 and clinical features before surgery［n（%）］

2.4 DFS 的单因素和多因素Cox 回归分析

Cox 回归分析显示，血清miR-135b、miR-141及TNM 分期是患者术后DFS 的独立影响因素（P＜0.05）。见表4。

表4 DFS 的单因素和多因素Cox 回归分析Table 4 Univariate and multivariate Cox regression analysis of DFS

2.5 OS 的单因素和多因素Cox 回归分析

Cox 回归分析显示，血清miR-135b、miR-141及TNM 分期是患者术后OS 的独立影响因素（P＜0.05）。见表5。

表5 OS 的单因素和多因素Cox 回归分析Table 5 Univariate and multivariate Cox regression analysis of OS

2.6 生存曲线分析

根据血清miR-135b、miR-141 的最佳界值，把所有患者分为miR-135b≥2.215 组、miR-135b＜2.215 组和miR-141≥1.120 组、miR-141＜1.120 组，Kaplan-Meier法绘制生存曲线OS 和DFS 生存函数曲线并行Log-Rank检验，miR-135b≥2.215 组、miR-141≥1.120 组具有更低的DFS 和OS。见图2。

图2 生存曲线Figure 2 Survival curves

miRNA 可以通过与靶mRNA 上的部分互补位点进行碱基配对来抑制基因表达，从而引发RNA降解或损害翻译。大量研究显示［7-8］，miRNA 可调节多种生物学功能，并且通常在病理条件下异常表达，如其可参与调节肿瘤发生、细胞增殖、凋亡和化学敏感性。目前，虽然关于miRNA 进入循环血液中的机制尚未完全明确，但通过PCR 法可检测到稳定的miRNA 并可将其量化，因此miRNA 有望成为肿瘤早期诊断和预后预测的生物标志物。本文回顾性分析了术前血清miR-135b、miR-141 在行结直肠癌根治术患者预后中的作用，通过ROC曲线的最佳界点对血清miR-135b、miR-141 进行二分类，进一步进行单因素和多因素的Cox 分析，并绘制OS 和DFS 的生存曲线，最终得出结论，即术前血清miR-135b、miR-141 是预测结直肠癌患者根治术后预后的有效标志物。

miR-135b 位于染色体1q32.1，在多种恶性肿瘤如结直肠癌、胃癌、肺癌等中明显过表达，可通过参与调控不同靶基因而在不同肿瘤的进展过程中发挥重要作用。张小鸿等［9-10］的研究显示，miR-135b可通过调控PTEN/PI3K/AKT 信号通路来影响结肠癌细胞的凋亡；
同时可以通过mTOR/p70S6K 信号通路使细胞周期发生阻滞。提示miR-135b 可作为一种促癌基因参与结直肠癌的生长过程。目前国内外相关研究多集中在肿瘤组织或粪便中，如Li 等［11］的研究指出，miR-135b 在结直肠癌患者粪便中表达显著上调，并与结直肠癌细胞的侵袭迁移有关。Moghadamnia 等［12］采用实时定量PCR 技术分析结直肠肿瘤组织和正常邻近组织中7 种结直肠癌相关的miRNA，结果显示miR-135b 在结直肠癌组织中的表达显著过表达。但关于血清miR-135b 在结直肠癌中的报道仍鲜见报道。袁平等［13］的研究指出，血清miR-135b 在结直肠癌患者中的表达量较正常健康者明显升高，并与结直肠癌的恶性程度、淋巴结转移的关系密切，与本研究结果基本一致。miR-141 在不同的癌症类型中可发挥抑癌或促癌作用，如在结直肠癌、肺癌、卵巢癌中显著过表达，但在胃癌、乳腺癌、胰腺癌中却明显低表达［14］本研究通过检测患者术前血清miR-141 的表达，进一步验证了其在结直肠癌进展过程中的作用，提示miR-141 在结直肠癌中具有一定的应用价值，可用于结直肠癌手术疗效及预后评估中。Sun 等［15］研究显示，miR-141 在晚期结直肠癌患者血浆中的含量较中晚期患者显著升高，提示miR-141 额表达可随着结直肠癌的恶化程度增加而上调。本研究结果也表明，miR-141 与的TNM 分期、分化程度、淋巴结转移有关，且术前更高血清miR-141 水平的患者的生存预后更差。

综上所述，术前血清miR-135b、miR-141 水平对结直肠癌根治术患者的术后预后具有良好的评估价值，且是患者术后生存的独立危险因素，有望成为判断其预后的潜在生物标志物，且可能是结直肠癌治疗的潜在靶点。