高效液相色谱法测定尿素的有关物质

李颖，谢莹莹，郑金凤，张悦，赵勇，刘杨，蒋赟（1.湖南省药品检验检测研究院，长沙 410001；
2.湖南省药品审查核验中心，长沙 410001；
3.国家药品监督管理局药用辅料工程技术研究重点实验室，长沙 410001）

尿素又称碳酰胺、脲，为药辅同源类，是临床上应用较早的强效利尿脱水药。本品具有抗菌，使蛋白质溶解、变性，增加蛋白质水合、皮肤通透性等作用，可用作透皮促进剂和助溶剂[1-2]。尿素对热不稳定，加热至150～160℃将脱氨成缩二脲，若迅速加热将脱氨而三聚成六元环化合物三聚氰酸。尿素在《中国药典》（ChP2020）、欧洲药典（EP10.0）、美国药典（USP2021）及日本药典（JP17）中均有收载[3-7]，其中USP2021对缩二脲杂质、其他单个杂质及总杂量进行了控制，EP10.0采用与标准缩二脲溶液制成的对照液进行颜色比对对缩二脲杂质进行了控制，而目前ChP2020并未对其有关物质进行控制。本研究通过高效液相色谱建立有关物质的检测方法，为药辅同源尿素的质量研究提供参考。

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪（岛津公司）；
e2695高效液相色谱仪（Waters公司）；
MS105DU 电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 试药

尿素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100288-201903，纯度：99.8%）；
缩二脲（麦克林，批号：C10871148，纯度：98%）；
三聚氰酸（麦克林，批号：C10691090，纯度：98%）；
缩三脲（上海旭东海普南通药业有限公司，批号：190601，纯度：99.0%）；
乙腈（Merck公司，批号：JA079030，色谱级）；
尿素样品信息见表1；
水为自制超纯水。

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters XBridge Amide（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）；
流动相：乙腈-水（94∶6）；
流速：1.0 mL·min－1；
检测波长：195 nm；
柱温：30℃；
进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 系统适用性溶液 精密称取缩二脲、缩三脲、三聚氰酸和尿素对照品适量，用75%乙腈溶解并稀释成质量浓度分别为0.005、0.005、0.005（约相当于0.1%的浓度）和5.0 mg·mL－1的混合对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取供试品适量，加75%乙腈溶解并稀释制成每1 mL中含5 mg的溶液，即得。

2.2.3 对照溶液 取“2.2.2”项下供试品溶液，加75%乙腈溶解并稀释制成每1 mL中含50 μg的溶液，即得。

2.2.4 杂质混合对照品溶液 精密称取缩二脲对照品约50 mg，置100 mL量瓶中，加75%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（1）；
精密称取三聚氰酸对照品约50 mg，置100 mL量瓶中，加75%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（2）；
精密称取缩三脲对照品约10 mg，置50 mL量瓶中，加75%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（3）。精密量取上述对照品储备液（1）～（3）适量，用75%乙腈稀释制成含缩二脲、缩三脲及三聚氰酸为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg·mL－1的系列溶液①～⑥，待用。

2.3 方法学验证

2.3.1 系统适用性试验 取“2.2”项下系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液、杂质混合对照品溶液及空白溶液分别进样，典型色谱图见图1。

图1 HPLC典型色谱图Fig 1 Typical chromatogram of HPLC

2.3.2 专属性试验 精密称取本品（N1）0.25 g 6份，置50 mL量瓶中，分别进行以下处理：

① 未破坏：按“2.2.2”项下方法处理；
② 酸破坏：加1 mol·L－1盐酸溶液2 mL，摇匀，室温放置24 h，用1 mol·L－1氢氧化钠溶液中和，加75%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
③碱破坏：加1 mol·L－1氢氧化钠溶液2 mL，摇匀，室温放置24 h，用1 mol·L－1盐酸溶液中和，加75%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
④氧化破坏：加30%双氧水2 mL，室温放置20 h，加75%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
⑤高温破坏：加75%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，放于120℃的烤箱中，加热8 h，即得；
⑥加75%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，放于（4500±500）lx光照强度下48 h （光照破坏），即得。以上样品按“2.1”项下色谱条件测定。结果表明，经酸、碱、氧化、高温、光照破坏条件破坏后，氧化破坏试验中新增1个杂质峰，按面积归一化法计算，总杂质增加6.7%；
高温破坏试验中缩二脲显著增加，按面积归一化法计算，总杂质增加2.75%，且各降解产物均能与主峰完全分离，均符合要求，见图2。

图2 专属性试验HPLC图谱Fig 2 HPLC chromatogram of specificity test

2.3.3 线性关系考察 分别精密量取“2.2.4”项下的系列溶液①～⑥各10 μL注入液相色谱仪，以质量浓度为横坐标（x，μg·mL－1），以峰面积（y）为纵坐标，结果各组分的回归方程分别为：y缩二脲＝2.365×105x－66.91，r2＝1.000；
y缩三脲＝3.165×105x－484.6，r2＝1.000；
y三聚氰酸＝1.393×105x＋307.6，r2＝0.9995。缩二 脲 在0.4966～19.8665 μg·mL－1，缩 三 脲在0.5375～21.5028 μg·mL－1，三聚氰酸在0.5842～23.3710 μg·mL－1与峰面积线性关系良好。

2.3.4 检出限和定量限 精密量取“2.2.4”项下各对照品储备液适量，分别逐级稀释，精密量取10 μL，进样测定。设定量限S/N＝10，检出限S/N＝3，结果缩二脲、缩三脲、三聚氰酸的定量限分别为0.020、0.0036、0.032 μg·mL－1；
检出限分别为0.0061、0.0011、0.0098 μg·mL－1。

2.3.5 精密度试验 取“2.2.4”项下溶液①，精密量取10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，结果缩二脲、缩三脲、三聚氰酸的峰面积RSD分别为0.24%、0.11%、0.58%（n＝6），说明本仪器的进样精密度良好。

2.3.6 重复性试验 取样品N1 1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.3”项下方法制备6份对照溶液，另取“2.2.4”项下溶液④，作为对照品溶液。取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，缩二脲、缩三脲和三聚氰酸按外标法以峰面积计算，其他杂质按自身对照法计算，结果缩二脲、缩三脲含量的RSD分别为1.5%、1.2%，未检出三聚氰酸和其他单个杂质，说明本方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 取同一加样回收试验的溶液，分别在0、2、4、8、12 h进样测定，记录各共有色谱峰峰面积，结果缩二脲、缩三脲、三聚氰酸峰面积RSD分别为0.18%、0.23%、3.2%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.8 回收试验 取样品（N1，缩二脲含量为0.0305%，缩三脲含量为0.0055%，三聚氰酸未检出），分别精密加入“2.2.4”项下对照品储备液①0.5 mL、对照品储备液②0.5 mL、对照品储备液③1.25 mL，按“2.2.2”项下方法平行制备6份溶液。另取溶液④作为对照品溶液。取上述溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。结果缩二脲的回收率为100.1%（RSD＝1.4%）；
缩三脲的回收率为100.3%（RSD＝0.44%）；
三聚氰酸的回收率为86.59%（RSD＝3.3%）（n＝6）。

2.3.9 耐用性试验 取“2.2.1”项下系统适用性试验溶液及“2.3.6”项下重复性试验溶液，在“2.1”项色谱条件下，通过改变有机相的初始比 例（±30%）、柱 温（±5℃）、流 速（±0.2 mL·min－1）以及更换不同品牌的液相色谱仪（岛津LC-20A和Waterse2695）来考察耐用性，观察各组分之间的分离情况以及有关物质含量的变化。结果系统适用性试验溶液在各个条件下各组分之间均能达到基线分离，重复性试验溶液中的有关物质含量无明显变化，表明方法的耐用性良好。

2.4 样品含量测定

取20批尿素样品，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液、对照溶液和对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算杂质含量，结果见表1。

表1 样品有关物质测定结果(%)Tab 1 Related substances of samples (%)

3.1 检测波长的选择

尿素合成过程中易发生脱氨缩合或聚合反应生成缩二脲、缩三脲和三聚氰酸等副产物[8-9]，在国内外药典中，仅USP2021收载了有关物质项，且单独控制了缩二脲单杂；
EP10.0仅对“缩二脲”进行了控制。用二极管阵列检测器（PDA）进行全波长扫描分析，缩二脲、缩三脲、三聚氰酸、尿素及破坏后形成新杂质的最大吸收波长都在195 nm附近，综合考虑，选用195 nm作为尿素有关物质的检测波长。

3.2 流动相的选择

USP2021中采用甲酸溶液（1 mL甲酸→1000 mL水）-乙腈梯度洗脱流动相体系，使用该体系进行操作时，因均在梯度上出峰，重现性不佳；
另有文献报道采用乙腈-水（88∶12）作为流动相[10-13]体系，经预试验，各色谱峰分离效果不佳。课题组研究发现，采用乙腈-水（94∶6）作为流动相体系时，尿素及其特定杂质色谱峰峰形较好，且各组分间分离效果最佳，故最终选用乙腈-水（94∶6）体系。

3.3 计算方法考察

USP2021中对缩二脲采用特定杂质对照品按外标法计算，其他单个杂质采用尿素对照品按外标法计算。本研究对收集到的20批样品，以缩二脲、缩三脲、三聚氰酸为特定杂质，分别采用外标法和自身对照法（按校正因子计算）计算，结果显示外标法计算缩二脲结果高于自身对照法，缩三脲低于自身对照法，三聚氰酸高于自身对照法。在相同色谱条件下，尿素、缩二脲、缩三脲、三聚氰酸的响应相差较大（尿素/缩二脲＝0.144；
尿素/缩三脲＝0.108；
尿素/三聚氰酸＝0.246），用自身对照法计算结果偏差较大，结果不准确。为更好地控制本品的质量，建议缩二脲、缩三脲、三聚氰酸采用外标法进行定量，其他未知杂质采用自身对照法进行计算。

本研究建立了高效液相色谱测定尿素的有关物质方法，方法学考察表明该方法结果准确，重复性好，主成分与各个杂质分离度较好，能准确测定特定杂质缩二脲、缩三脲、三聚氰酸的含量，为药用辅料尿素质量控制提供依据。样品测定结果显示，20批样品均检出缩二脲和缩三脲，5批样品检出三聚氰酸。其中缩二脲含量相对较高，有4批样品中缩二脲的含量均已超出了USP2021中对缩二脲的控制限度（不得过0.1%），应加强质量控制。