ATF4通过调控HKDC1对肝癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

张 黎，崔 杰，王安琪，孙国平

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及病死率分别位居世界第6和第3，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌中最常见的类型，占所有肝癌病例的75%～85%。目前，系统性化疗是肝癌患者的重要治疗手段，但由于治疗耐药性，晚期HCC患者在很大程度上仍无法缓解。因此，探索肝癌发生分子机制，寻找肝癌治疗新靶点，对肝癌患者的治疗有着极其重要的临床意义。

细胞内外各种因素如低氧、营养缺乏、氧化应激、Ca浓度改变等刺激，可使未折叠或错误折叠蛋白质在内质网中累积，导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)和随后的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)的激活，研究表明ERS能通过调节肿瘤微环境来影响肿瘤进展和治疗。转录活化因子4 (activating transcription factor 4, ATF4)是参与UPR的蛋白激酶R样内质网激酶(proteinkinase R-like ERkinase, PERK)途径的重要组成部分，ATF4及其靶基因与肿瘤血管生成和转移有关，ATF4是治疗癌症的潜在靶点。相关研究表明己糖激酶结构域成分1(hexokinase domain component 1，HKDC1)可能是ATF4转录识别的靶点之一，HKDC1是近年发现的第五种己糖激酶，现已有研究表明HKDC1可能在乳腺癌、肺癌、结直肠癌及淋巴瘤中发挥致癌作用，但目前HKDC1在肝癌中的研究机制甚少。该研究通过观察敲低ATF4及HKDC1对HCC增殖、迁移及凋亡的影响，探讨其可能的分子机制。

1.1 材料

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细胞株及培养 人HCC细胞株HepG2、Huh7(购自中国科学院上海细胞库)；
在含1%链霉素、1%青霉素和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，细胞置于含5% CO的37 ℃加湿培养箱中培养，根据细胞生长状态及时换液和传代。

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主要试剂 胎牛血清、DMEM高糖培养基(以色列BI公司)；
青-链霉素(美国Gibco公司)；
胰蛋白酶、RIPA细胞裂解缓冲液、PMSF蛋白酶抑制剂(上海碧云天生物技术公司)；
通用型ECL化学发光显影试剂盒(美国 ThermoFisher公司)；
抗Bcl-2(BS1511)、Bax抗体(BS2538)(美国Bioword公司)；
抗GAPDH抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(美国Biolegeng公司)；
抗ATF4抗体(美国Proteintech公司)；
抗HKDC1抗体(北京Bioss公司)；
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、CCK-8试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)；
脂质体Lipofectamine2000(美国Millipore公司)；
ATF4小干扰RNA及其对照siRNA(上海吉玛公司)；
结晶紫染色液(杭州吴鑫公司)；
高纯度质粒小量快速提取试剂盒(北京Biomed公司)。

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主要仪器 酶标仪(美国Bio-Tek公司)、流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)、化学发光成像分析仪(美国GE公司)。

1.2 方法

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质粒提取 取200 μl菌液(shNC、shHKDC1)于10 ml含有氨苄抗生素的液体LB培养基中,200 r/min、37 ℃振荡培养过夜，次日根据质粒提取试剂盒按步骤提取质粒后上机检测浓度。

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细胞转染 预先将HepG2和Huh7接种于6孔板中，待细胞生长融合率达50%～60%开始转染，将细胞分组设置为阴性组(si-NC、shNC)、转染组(si-ATF4、shHKDC1)，按照Lipofectamine2000说明书进行转染，6 h后将无血清的Opti-MEM培养基更换为含10%血清的完全培养基，转染后继续培养48 h用于后续实验。序列信息如下：si-NC:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′(F)，5′-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3′(R);siATF4:5′-CCUGAA AGAUUUGAUAGAATT-3′(F),5′-UUCUAUCAAAUC UUUCAGGTT-3′(R);shNC:5′-TTCTCCGAACGTGT CACGT-3′;shHKDC1:gcCTTGCTAATACAAGAGA GA。

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CCK-8法检测细胞增殖 将HepG2和Huh7以每孔100 μl的接种量(细胞密度为3×10个/ml)接种于96孔板中，每组设置6个复孔，分别在转染后24、48、72 h加入CCK-8检测试剂(10 μl/孔)，继续孵育2 h后使用酶标仪检测在450 nm处的吸光度(optical density,OD)。

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克隆形成实验检测细胞增殖 将转染后的细胞按500个/孔接种于6孔板中，培养1～2 周，直至肉眼可见克隆形成结束培养，用PBS轻轻清洗3次后，用4%多聚甲醛固定15 min，再用0.5%结晶紫染色30 min，在显微镜下观察对照组和转染组克隆数目(细胞数>50个计为一个克隆)。

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流式细胞术检测细胞凋亡 细胞转染48 h后用0.25%的胰蛋白酶(不含EDTA)消化，用预冷的PBS洗涤细胞2次，离心收集细胞后用400 μl膜联蛋白V(Annexin V)结合缓冲液重悬，加入5 μl异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)室温下避光孵育15 min，再加入5 μl碘化丙啶(propidium,PI)室温下避光孵育5 min后上机检测，获取数据后使用CytExpert软件进行分析。

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划痕实验检测细胞迁移 将转染后的细胞按5×10个/孔接种于6孔板中，待细胞生长融合率达90%，用Marker笔在6孔板背面划3条直线，用200 μl枪头垂直板面匀速划痕，使划痕线垂直于3条标记线，用PBS洗去脱落细胞后加入无血清培养基继续培养，分别于培养0、24 h后在4倍光学显微镜下拍照(选取标记线与划痕相交处拍照，保证2个时间点拍照视野一致)用Image J软件分析并计算划痕愈合率=(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%。

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Western blot检测相关蛋白的表达 细胞转染48 h后加入含PMSF的RIPA裂解液置于冰上裂解30 min后刮取细胞裂解物，4 ℃，14 000 r/min离心15 min后收集上清液；
使用BCA试剂盒进行蛋白定量；
在蛋白上清液中加入4×Loading buffer后在100 ℃条件下加热10 min制备蛋白样品；
用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，并将其转移至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h，用特异性一抗在4 ℃下孵育过夜，包括ATF4(1 ∶1 000)、HKDC1(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶2 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000),再用相应的二抗(1 ∶10 000)在室温下孵育2 h，最后用ECL发光显影检测蛋白；
用Image J软件进行条带分析并计算其灰度值。

2.1 敲低ATF4对肝癌细胞增殖的影响

用CCK-8法和克隆形成实验来检测si-NC组和si-ATF4组肝癌细胞的增殖情况。CCK-8结果显示,与si-NC组相比，敲低ATF4抑制肝癌细胞增殖能力，差异有统计学意义(

t

=3.408,

t

=6.261,

t

=7.393;

t

=5.271,

t

=9.135,

t

=9.853;均

P

<0.01)(图1A)；
克隆形成结果显示，与si-NC组相比，敲低ATF4抑制肝癌细胞克隆形成能力，差异有统计学意义(

t

=17.270,

t

=16.280;均

P

<0.01)(图1B)。

图1 敲低ATF4对HepG、Huh7细胞增殖和克隆形成的影响

2.2 敲低ATF4对肝癌细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，24 h后si-ATF4划痕组愈合率较si-NC组低，差异有统计学意义(

t

=17.420,

t

=19.310;均

P

<0.01)(图2)。结果表明抑制ATF4基因的表达可能抑制肝癌细胞的迁移潜能。

图2 敲低ATF4对HepG2、Huh7细胞迁移的影响 ×4与si-NC组比较：**P<0.01

2.3 敲低ATF4对肝癌细胞凋亡率的影响

流式细胞术检测结果显示,与si-NC组比较，抑制ATF4基因的表达后，HepG2和Huh7细胞凋亡增加，差异有统计学意义(

t

=8.786,

t

=6.872;均

P

<0.01)(图3A)；
为了进一步探究敲低ATF4诱导肝癌细胞凋亡的机制，用Western blot检测肝癌细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达情况，结果显示,敲除ATF4可上调肝癌细胞中Bax蛋白的表达而下调Bcl-2蛋白的表达，相较于si-NC组，si-ATF4组Bcl-2/Bax的比值显著降低，差异有统计学意义(

t

=22.710,

t

=37.950;均

P

<0.01)(图3B)。

图3 敲低ATF4诱导HepG2、Huh7细胞凋亡

2.4 ATF4通过调控HKDC1对肝癌细胞增殖产生影响

为了探究ATF4在肝癌细胞中对HKDC1的调控作用，该研究在HepG2和Huh7细胞系中敲除ATF4后，用Western blot检测HKDC1基因的表达，结果显示沉默ATF4可以下调肝癌细胞中HKDC1蛋白的表达,差异有统计学意义(

t

=12.340,

t

=5.586;

t

=13.850,

t

=14.850;均

P

<0.01)(图4A)；
为了进一步探究HKDC1在肝癌细胞中的作用，在HepG2和Huh7细胞系中敲除HKDC1后，进行细胞增殖和凋亡检测，结果发现敲除HKDC1后，CCK-8检测发现两种细胞系的增殖均受到抑制(

t

=4.393,

t

=9.673,

t

=6.747;

t

=5.677,

t

=9.960,

t

=10.750;均

P

<0.01)；
另外，流式细胞凋亡术结果显示，与shNC组对比，抑制HKDC1的表达后，HepG2和Huh7细胞凋亡增加，差异有统计学意义(

t

=7.836,

t

=9.016;均

P

<0.01)(图4B、C);划痕实验结果显示,与shNC组相比，shHKDC1组肝癌细胞迁移能力降低，差异有统计学差异(

t

=14.830,

t

=20.420;均

P

<0.01)(图4D)。

图4 ATF4可能通过靶向HKDC1促进HepG2、Huh7细胞增殖迁移 ×4

在低氧、营养缺乏的肿瘤微环境下，肿瘤细胞仍可生存下来，这可能与导致细胞存活的压力相关信号通路的激活有关，ATF4是其中的关键介质，其通过参与氧化还原稳态、自噬和血管生成的基因转录来促进肿瘤细胞存活，维持肿瘤代谢的平衡，目前已有关于在肝癌治疗中靶向ATF4途径增强细胞药物敏感性的相关研究的报道。与正常组织相比，ATF4在肿瘤组织中表达增高，其在肿瘤进展中的作用已被证实。为了研究ATF4在肝癌细胞生长中的作用，该研究使用ATF4特异性的siRNA有效抑制ATF4在肝癌细胞株HepG2和Huh7中的表达后，观察肝癌细胞体外增殖迁移能力和凋亡的变化，结果显示细胞内Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达降低，肝癌细胞凋亡增加且增殖迁移受到抑制。为进一步观测其长期效应，采用相同的方法研究其对肝癌细胞克隆形成的影响，发现沉默ATF4的表达后成功抑制了肝癌细胞的克隆形成。

ATF4是由各种应激和病理诱导的适应性综合应激反应(ISR)的关键调节因子，相关研究表明，内质网应激可诱导ATF4介导的HKDC1基因的转录上调，HKDC1基因是ISR的一个新的候选成分，ISR期间HKDC1的上调通过刺激葡萄糖在细胞内聚集，并将其驱动至糖酵解过程中，有助于克服应激期间能量的缺乏。该研究假设ATF4通过上调HKDC1的表达来增强肝癌细胞的增殖及迁移能力，研究显示抑制ATF4在肝癌细胞株HepG2和Huh7中的表达后，蛋白表达下调，证实了在HCC中ATF4对HKDC1蛋白表达的调节作用。有研究表明，肿瘤细胞能量代谢方式发生改变，即使在氧气充足的情况下，肿瘤细胞仍主要利用糖酵解而不是氧化磷酸化来产生能量，这种现象被称为“Warburg效应”，这种肿瘤细胞中的有氧糖酵解反应能产生大量三磷酸腺苷(ATP)和生物合成所需的代谢中间体，以满足肿瘤生长和恶性进展中大量的生物合成和能量需求，是肿瘤细胞生长、增殖及转移的重要因素之一。己糖激酶(HKs)是糖酵解第一步的关键代谢酶，其中，HKDC1是一种新的HK亚型，据相关研究表明，HKDC1在肿瘤组织中表达增多，是一种新的潜在的肺癌治疗靶点。该实验通过抑制HKDC1在肝癌细胞中的表达来观察其对肝癌细胞生物学行为的影响，结果显示敲低HKDC1的表达对HepG2和Huh7肝癌细胞株有增殖抑制和诱导凋亡的作用。该研究进一步证实ATF4可能作用于HKDC1并增强其表达，从而在肝癌细胞的增殖、转移中发挥作用。综上所述，该研究证实了ATF4和HKDC1在HCC进展中的作用，是肝癌治疗的候选靶点。

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