冷休克法诱导乌蒙山金线鲃三倍体及其生长分析

华泽祥，郗啟文，陈 俊，陈家磊，武祥伟，黄松茂，赵玉姣，张铭枭

(1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；
2.云南省水产技术推广站，昆明 650034)

鱼类多倍体育种是细胞工程育种的重要内容，而三倍体育种又是多倍体育种的主要方向。理论上三倍体鱼类卵原细胞不能完成正常的减数分裂，具有较高的不育性，因而能将更多能量用于个体生长，具有生长速度快、肉质好、抗逆性强等优点。国内外已在鲤()、黄颡鱼()、团头鲂()、乌鳢()、虹鳟()、大西洋鲑()等40余种淡、海水鱼类中成功诱导了三倍体。其中，虹鳟、大西洋鲑等三倍体育种体系最为成熟，已在世界范围内商业化推广养殖。国内不仅在多种经济鱼类中成功获得了三倍体，而且开发了多种三倍体人工诱导技术，例如异育银鲫()、湘云鲫()、湘云鲤()等建立了完善的三倍体育种技术体系，三倍体品种获得了规模化推广养殖。

乌蒙山金线鲃()隶属于鲤科(Cyprinidae)鲃亚科(Barbinae)金线鲃属()。金线鲃属是我国特有鲃亚科鱼类，也是鲃亚科的最大属。云南分布有金线鲃属鱼类30余种，乌蒙山金线鲃即是其中一种，主要分布于云南省乌蒙山主峰地区的地下暗河与龙潭中，目前已在云南曲靖、昆明等地多个养殖场驯化养殖。金线鲃属鱼类多为小型鱼类，其遗传改良及养殖业发展缓慢。乌蒙山金线鲃个体大，具有较大的开发利用潜力，乌蒙山金线鲃三倍体的诱导与培育将为其遗传改良开辟新的途径。但目前尚无金线鲃属鱼类人工诱导三倍体的报道，本研究建立了乌蒙山金线鲃三倍体诱导方法，并比较分析了三倍体与二倍体仔稚鱼的生长特征，以期为其遗传改良与倍性育种奠定基础。

1.1 实验材料

乌蒙山金线鲃购自云南省寻甸县金线鲃养殖场，体表无病无伤、体质健壮、性成熟的3龄雌、雄亲鱼各30尾，体重分别为(134.48±21.21) g和(84.77±18.62) g，采用LRH-A2和绒毛膜促性腺激素(宁波第二激素厂，宁波)人工催产促使成熟，并挤取精卵进行人工授精，受精卵等分成若干份作为诱导组与对照组，每组200枚受精卵布于直径15厘米玻璃培养皿中，实验在云南农业大学水产试验场进行。

1.2 冷休克实验设计

本研究参考文献[1-4]，设置2～3 ℃为诱导温度，起始诱导时间设置为受精后3、4、5 min起始诱导组3个实验组，持续诱导时间为10、15、20、25、30 min，每组设置3个重复。

1.3 仔鱼培育

将诱导组与对照组置于17～18 ℃的微流水中孵化出膜，每组仔鱼置于小型网箱中(网箱网衣为40目，长×宽×高=20 cm×20 cm×30 cm)，所有网箱置于水深50 cm的玻璃钢养殖槽中室内微流水培育；
开口饵料为蛋白含量34%的鲤科鱼类粉状开口料，每天投喂3次，投喂及摄食期间停止流水。

1.4 倍性鉴定

每组随机取30尾未开口摄食的初孵仔鱼制备单细胞悬液，使用双蒸水将仔鱼清洗2次，移入1.5 mL离心管中，加入1 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.4)后破碎仔鱼，悬液经300目细胞筛过滤至2 mL离心管中，并补加0.5 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.4)，4 ℃下4 000 r/min离心1 min，弃上清1 mL，剩余浓缩液重悬即为单细胞悬液。使用流式细胞仪(Beckman Coulter,CytoFlex,USA)测定DNA含量。乌蒙山金线鲃二倍体初孵仔鱼作为对照，上机前使用溴化碘碇(PI)对制备的单细胞染色2 min，当诱导组细胞DNA相对含量是二倍体的1.5倍时判定为三倍体。

1.5 受精、孵化及生长数据收集与处理

统计每组200枚卵的受精率、孵化率、畸形率及三倍体率。受精后12 h统计各组受精率(原肠中后期胚胎占总卵数的比例)，全部出膜孵化后统计各组孵化率(孵化出膜的受精卵数占总受精卵数的比例)；
孵化出膜7 d后计算畸形率(畸形个体数占孵化仔鱼总数的比例)；
开口摄食前计算各组三倍体率(即三倍体个体的比例)，并计算孵化时间(第一个仔鱼孵化出膜的时间)。

初孵仔鱼开口摄食前测量体长(精确至0.01 mm)，在60日龄与180日龄测量体长与体重(精确至0.01g)，每组每次随机测量30尾个体。使用SPSS 18.0软件进行数据分析，同一因素下不同水平采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，显著水平为<0.05。

2.1 诱导条件

受精3 min起始诱导组(图1A)，三倍体率为4.17%～31.50%，受精率为56.05%～68.38%、孵化率为40.33%～47.08%，畸形率为41.66%～71.25%，20 min时三倍体率(31.50%)最高。

受精4 min起始诱导组(图1B)，三倍体率为10.00%～75.00%，诱导25 min时三倍体率最高，畸形率(41.07%)较高，孵化率(41.52%)最低，受精率(74.64%)较高。

受精5 min起始诱导组(图1C)，三倍体率分别为15.00%、87.50%、85.50%、100%、100%，诱导25 min时三倍体率为100%，受精率(64.55%)与孵化率(60.61%)最高，而畸形率(26.54%)最低。

图1 乌蒙山金线鲃三倍体诱导的受精率、孵化率、畸形率与三倍体率Fig.1 Fertility rate,hatching rate,aberration rate,and triploid rate in the triploid-induced S.wumengshanensisA、B、C.诱导起始时间受精后3、4、5 min；
同组立柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；
下图同

5 min起始诱导组仔鱼死亡率随着诱导时间延长呈增加趋势，最大死亡率为39.38%(诱导30 min)；
3 min与4 min起始诱导组的死亡率先增加，最大死亡率分别为26.88%(诱导20 min)与33.65%(诱导15 min)，之后逐渐降低(图2)。

图2 乌蒙山金线鲃三倍体不同诱导组仔鱼孵化7 d的死亡率Fig.2 Fries mortality of the different triploid-induced groups at the post-hatching seven days in S.wumengshanensis

诱导组平均孵化时间为4 d 14 h～6 d 19 h，均少于对照组(7 d 2 h)，并且随着持续诱导时间的增加，诱导组平均孵化时间呈递减趋势(表1)。因此，受精后5 min起始诱导，持续诱导25 min是乌蒙山金线鲃三倍体最佳的诱导条件。

表1 乌蒙山金线鲃三倍体诱导孵化时间Tab.1 Hatching time of the triploid-induced S.wumengshanensis

2.2 三倍体与二倍体仔稚鱼的生长差异

3日龄乌蒙山金线鲃三倍体与二倍体的体长分别为(5.67±0.23) mm、(5.36±0.29) mm，无显著差异，至180日龄三倍体的体长与体重分别为(74.00±1.58) mm、(4.46±0.30) g，分别是二倍体的1.09倍、1.27倍，并且体重显著大于二倍体个体。3～60日龄三倍体与二倍体个体的体重、体长均无显著性差异。

表3 乌蒙山金线鲃三倍体与二倍体的生长Tab.3 Growth of the triploids and diploids of S.wumengshanensis

3.1 三倍体的诱导条件

乌蒙山金线鲃属温水性鱼类，本研究采用冷休克温度2～3 ℃诱导其三倍体，可获得较高的三倍体率(100%)与较低的畸形率(26.54%)，而温水性鱼类鳜()和黄颡鱼()冷休克诱导三倍体的最佳温度分别为0～1 ℃与3～5 ℃，亦与本研究的结果相一致。有学者认为不同鱼类的遗传背景及繁殖生物学不同，它们对温度的敏感度也不同，暖水性或温水性鱼类诱导三倍体宜用冷休克法，休克温度约0～5 ℃，冷水性鱼类则宜用热休克法，休克温度为28～36 ℃，本研究也呈现相似的规律。

不同鱼类受精卵第二极体排出时间各异，三倍体起始诱导时间也不同，一般而言暖水性与温水性鱼类较早，冷水性鱼类则较晚。例如暖水性鱼类斗鱼()、奥里亚罗非鱼()的起始诱导时间为受精后2～3min，诱导率分别为86%与100%；
而温水性性鱼类如鲤()、团头鲂()、乌鳢()等的诱导起始时间多为受精后3～5 min，可获得60%～100%的诱导率；
冷水性鱼类虹鳟()、大西洋鲑()、细鳞鲑()、马苏大马哈鱼()等则需受精后10～25 min，可获得90%以上的诱导率。由此可知，起始诱导时间是范围值，即使同一种鱼类受精卵发育速度也并非一致，较难确定第二极体排放的统一时间点。乌蒙山金线鲃为偏冷水性鱼类，受精后5 min的诱导率可达100%，高于受精后3 min与4 min的诱导率，这与温水性鱼类三倍体诱导规律相符。

持续诱导时间太短则无法完全抑制第二极体排放，降低诱导率。已有研究显示热休克法需时较短，多数为2～5 min，而冷休克法需时较长，多数为15～30 min，并且需时长短与鱼类种类及其适温范围无关联。本研究采用冷休克法诱导乌蒙山金线鲃三倍体，诱导时间为25 min与30 min时均可获得100%的诱导率，这与已报道的冷休克法时间规律相一致。此外，乌蒙山金线鲃三倍体诱导10～30 min时三倍体率逐渐增加，表明一定范围内鱼类三倍体诱导时间越长诱导率越高。

3.2 三倍体生长优势

三倍体鱼类可以提高生长速度、养殖产量、肉质等，然而并非所有三倍体鱼类的生长都优于二倍体，尤其在幼鱼期或性成熟前三倍体个体常无生长优势。CAL等报道大菱鲆()三倍体个体性成熟前无生长优势，但初次性成熟后其生长速度显著快于二倍体。本研究中3～60日龄乌蒙山金线鲃三倍体与二倍体的体长、体重均无显著差异，而180日龄后三倍体体重显著大于二倍体，但体长仍无显著差异。本研究结果与鳜()三倍体生长相似，10～40日龄鳜三倍体生长速度与二倍体无显著差异，而60～150日龄三倍体生长速度显著快于二倍体。

综上所述，本研究采用冷休克法诱导了乌蒙山金线鲃三倍体，最佳诱导条件为2～3 ℃，受精后5 min起始诱导，持续诱导时间25 min，可获得最大受精率与孵化率，最小畸形率及100%诱导率；
60日龄前三倍体与二倍体的生长无显著性差异，而180日龄三倍体的体重显著大于二倍体。