黄淮南片麦区部分小麦品系Vrn1基因检测及其效应分析

朱雪成， 刘 静， 马红勃， 王 静， 刘立伟， 冯国华， 刘东涛

(江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，江苏徐州 221131)

小麦是世界主要粮食作物之一，因具有极强的适应性而在全球广泛分布。从极地附近的北欧地区到赤道附近的北非，从盆地吐鲁番到“世界屋脊”青藏高原都有小麦的身影。小麦极强的适应性主要得益于其长期演化出的不同生态发育类型。

小麦的生态发育类型主要受其本身的春化特性和光周期特性影响。春化特性是指小麦在营养生长时期需要经历一定时间和一定范围的低温，才能够进入生殖生长阶段，进而抽穗开花并且灌浆成熟的特性。根据其对低温范围和低温时间要求的不同，一般将小麦品种划分为春性、半冬性、冬性、强冬性4类。春性品种对春化要求最低，不需要低温阶段即可抽穗开花；
而强冬性品种一般需要 0～3 ℃下40～50 d的低温才能够通过春化阶段，否则不能抽穗开花。目前报道控制小麦春化特性的基因包括、、这3个开花促进因子，和1个开花抑制因子。作为开花抑制因子，发生突变时小麦表现为早花和春性，但是由于基因包含2个功能冗余的基因，因此只有在小麦3个位点同时突变时该基因才会失去功能，目前在自然界中尚未发现该类型小麦。的显性等位变异是在启动子上插入了一个逆转座子，该突变可以降低小麦春化需求，但是仅在极少数品种中出现这类变异。基因位于小麦5D染色体的短臂上，且十分靠近着丝粒，该基因受春化作用调节小麦的生殖生长，其功能与下文中的、基因相似且弱于，关于的研究有待进一步深入。

目前研究最为深入的春化基因——基因，在六倍体普通小麦当中存在3个部分同源基因：、、，分别被定位在5A、5B、5D染色体的长臂上。在位点具有、、这3个显性等位变异。这3种显性等位变异分别在启动子和第一内含子区域发生了片段插入、序列复制、缺失以及碱基突变，导致表达量上升，降低春化需求。基因目前已发现3种显性等位变异类型，分别是、、。该位点的显性等位变异均是在第一内含子区域发生的缺失、碱基突变以及序列重复。位点存在3个显性等位变异：、、，与隐性基因相比，的第一内含子缺失了一段4 235 bp的序列；
在缺失相同片段的同时，还在翻译起始位点上游161 bp处发生单碱基突变；
在启动子区域有175 bp碱基的插入。有学者认为，的3个部分同源基因当中至少有一个为显性时，那么该小麦品种表现为春性性状；
当这3个等位基因全为隐性时，小麦表现为冬性性状。但是春化特性并不是简单的质量性状，而是存在中间过渡区域的数量性状。也有研究认为，携带等位变异、品种分别表现为弱春性和半冬性。赵虹等曾对黄淮南片麦区的部分小麦品种进行春化基因分子标记鉴定，认为目前仅用春化基因来确定品种冬春性存在一定的不完善之处。除了生育期性状，春化基因还对小麦农艺性状和产量具有一定影响。简俊涛等对我国366份小麦品种进行研究，发现我国小麦春化基因的多样性主要在位点上。

黄淮南片麦区作为我国重要的粮食产区，地处南北方过渡地带，属于大陆性季风气候，近几十年来气候异常导致早期低温冻害、春季倒春寒、后期干热风等气象灾害频发，小麦的安全生产受到严重威胁。近年来，小麦审定品种急剧增加，但这些新品种(系)的春化基因类型并不清楚。本研究利用分子标记鉴定了黄淮麦区部分品种的春化基因类型，并分析了不同基因型品种的生育期以及冬季抗寒性特点，以期为高产稳产小麦新品种培育提供参考。

1.1 试验材料和地点

试验材料为2020—2021年度参加国家黄淮南片水地组区试参试材料82份、国家黄淮南片冬水组中种联合体区试参试材料12份、江苏省淮北片小麦区试材料27份以及江苏省徐州农科所科企淮北小麦联合体参试材料15份，共计136份小麦新品系。试验地点为江苏省徐州市，采用随机区组设计，重复3次，小区面积13.34 m，机械条播。

1.2 春化基因的分子标记鉴定

采用改良CTAB法提取小麦基因组DNA，取样时每份材料取3个不同单株上的叶片，以保证结果的准确。

基因检测根据Yan等设计的春化基因、、的STS特异性分子标记引物，详细信息见表1。所有引物均由生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系为10 μL，包括模板DNA 30～40 ng、10×buffer 1 μL、dNTPs 150 μmol/L、DNA聚合酶1 U，引物VRN1AF/VRN1-INT1R为每条3 pmol，其他引物为每条引物5 pmol。取3 μL的PCR反应产物于1.5%的琼脂糖凝胶(含goldview)中进行电泳分离检测，电泳缓冲液为1×TBE溶液。120 V电泳 30～40 min 后，用Bio-RAD凝胶成像系统拍照成像并保存。

表1 春化基因位点Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1引物序列、扩增片段及其相关信息

1.3 田间性状的记载和数据分析

幼苗习性：在12月20日前后记载，分匍匐、半匍匐、直立3种类型。

越冬期冻害：越冬期在寒流过后10 d左右分2个阶段记载，分5级。1级：无冻害；
2级：叶尖受冻发黄不超过1/3；
3级：叶片冻死1/3至1/2；
4级：叶片全枯；
5级：植株或大部分分蘖冻死。

抽穗期：以50%以上植株的顶端第1小穗露出叶鞘的日期为准，从播种到抽穗的日数为抽穗期。

成熟期：75%麦穗中部籽粒形态、大小及颜色接近本品种正常状态，籽粒变硬(用指甲不易划破)的日期，从播种到成熟的日数为成熟期。

数据分析采用 Excel 和 SPSS 20 软件，进行独立样本T测验、方差分析及相关性分析，差异显著水平为5%。

2.1 Vrn1基因等位变异的分子检测

供试材料分子标记检测结果详见表2。在位点上，首先利用引物VRNA1F/VRN1-IN1R检测，所有材料都扩增出了734 bp的条带，并没有965+876、714 bp的条带产生(图1-A)。说明这些材料的基因型可能是或；
进一步检测结果中，在引物 Intrl/A/F2、Intrl/A/R3检测下没有条带产生(图1-B)，在Intrl/C/F、Intrl/AB/R检测下都扩增出了1 068 bp的条带(图1-C)，说明供试材料在位点上均为隐性基因。

表2 供试材料及其Vrn1基因的等位变异

检测位点时，在特异引物Intrl/B/F与Intrl/B/R3的扩增下所有材料没有条带产生(图2-A)；
在Intrl/B/F与Intrl/B/R4引物中都扩增出了1 149 bp的条带(图2-B)。说明在该位点上供试材料均为隐性基因。

而在位点上有漯麦68等31份材料在引物Intrl/D/F与Intrl/D/R3的检测下扩增出了1 671 bp大小的条带(图3-A)，其余材料没有条带；
在引物Intrl/D/F与Intrl/D/R4的检测下，这31份材料没有条带产生，泛麦26等105份材料扩增出997 bp大小的条带(图3-B)；
2对引物结果互补。说明泛麦26等105份材料携带在位点上为隐性基因，占比77.2%；
而漯麦68等31份材料可能为或。利用另2对引物进一步检测，显示漯麦68等31份材料在引物VRN1DF/VRN1-SNP161CR的扩增下没有条带产生(图3-C)，而在VRN1DF/VRN1-SNP161AR引物下都扩增出612 bp(图3-D)的条带；
说明全部携带显性等位基因，占比22.8%。

2.2 春化基因对小麦生育期的效应

由表3可知和基因型小麦品种在抽穗期上存在显著差异，携带的材料平均抽穗期182.77 d，比携带隐性基因的材料早抽穗1.09 d。携带基因的小麦成熟期平均值为234.32 d，平均比春化基因全为隐性的材料早成熟0.22 d，2种基因型间在成熟期上差异并不显著。

表3 春化基因Vrn-D1对小麦生育期的影响

2.3 春化基因型、苗期习性与冬季冻害程度的关系

根据苗期习性将供试材料分为匍匐、半匍匐、直立3类。如图4所示，基因型中的匍匐、半匍匐、直立的品种分别占3.23%、67.74%、29.03%；
在基因型中该比例分别为7.62%、62.86%、29.52%；
2种基因型中各苗期习性品种占比十分接近。可见显性基因对小麦苗期习性并无显著影响。

由表4可知，携带春化基因的材料与春化基因全为隐性的材料之间冻害程度差异不显著。匍匐、半匍匐的品种的平均冻害程度分别为1.89、2.06，但是两者差异不显著；
而苗期习性为直立的材料平均冻害程度为2.60，与以上2类差异达到显著水平。可见苗期习性为匍匐、半匍匐的小麦品种抗寒性较强，苗期直立的材料抗寒性较弱；
显性等位变异对小麦的抗寒性没有显著影响。

表4 不同春化基因型、苗期习性品种的冬季冻害差异性分析

2.4 小麦生育期与冬季抗寒性的相关性分析

由表5可知，小麦抽穗期与成熟期呈极显著正相关，相关系数为0.32，说明抽穗越早的品种其成熟期也越早；
抽穗期与越冬期冻害呈显著负相关，相关系数为-0.19，即抽穗越早的品种越冬期冻害严重，冬季抗寒性差。

表5 小麦生育期与冻害的相关性

3.1 Vrn-D1的分布频率

李哲等曾对来自我国小麦主产区的276份品种进行春化基因检测，发现显性基因主要分布在东北北部春麦区和西北春麦区，显性基因主要分布在东北春麦区、西北春麦区和西南冬麦区；
而显性基因的分布非常广泛，在长江中下游冬麦区、西南冬麦区、东北春麦区、西北春麦区和黄淮冬麦区都有分布。这与本研究中黄淮麦区小麦的显性春化基因都集中在位点上的结果相一致。郭宪瑞等曾对黄淮麦区小麦品种中、这2种显性等位变异进行检测，在他们的结果中，在黄淮麦区品种中的分布频率分别为11.5%和19.7%。而本次试验的供试材料中并未出现显性等位变异。考虑到前者的试验材料选育时间的分布较为广泛，甚至包含一些年代久远的地方品种，而本研究的试验材料均为近2年参加大区试验的新品种(系)，猜测可能的原因是基因的春性效应较强，已经不适应如今黄淮麦区的气候变化或栽培措施，导致其在育种过程中正被逐渐淘汰。

3.2 春化基因与抗寒性

黄淮麦区的品种主要是春化基因全为隐性的冬性品种和携带显性春化基因的弱春/半冬性品种。近年来黄淮麦区冬季低温冻害和春季倒春寒频繁发生，严重威胁粮食生产安全，因此提高主栽品种的抗寒性愈发重要。游光霞等认为基因全为隐性的品种冬季抗寒性较好，在育种过程中也有很多育种家根据冬春性来判断品种的抗寒性。而新的研究表明小麦的冬春性和抗寒性属于2种特性，受2种基因控制，只是由于基因连锁的原因，大多数春性品种抗寒性较差。本研究结果显示，显性等位变异-对小麦越冬期抗寒性并无显著影响。有部分品系(现麦686、郑研麦176、轮选124等)的3个位点全为隐性，根据洛阳农林科学院国家小麦冬春性鉴定结果显示也均为冬性，抽穗期较均值迟2 d以上，但这些品种在苗期表现为直立，冻害也达到3级，说明依据冬春性来判断小麦抗寒性的方法有待商榷。小麦的抗寒性除了抗冬季低温还包括抗春季倒春寒，本年度春季未发生明显的倒春寒现象，所以供试材料的抗倒春寒能力并未体现出差异。在以后的研究中将结合生理生化指标进行田间直接鉴定或者人工气候室模拟鉴定，对小麦倒春寒抗性进一步研究。