响应面法优化复合枸杞果酱的制备工艺及体外抗氧化活性研究

刘耀耀，乔杨波，叶 英,2，祁生妍，蒋 涛*

(1.青海大学农牧学院，青海西宁 810016；
2.青海省青藏高原农产品加工重点实验室，青海西宁 810016)

枸杞在世界各国都有分布，有80余种，我国主要分布于山西、青海、新疆、陕西、河北、内蒙古等地。枸杞是传统的药食同源植物，其花、皮、果、根、叶均可入药，有较高的药用保健功能和营养价值，如美容养颜、降低血糖、抗衰老等。枸杞有多种药用成分，包括维生素、多糖、类胡萝卜素、类黄酮、微量元素等。百香果又称西番莲、鸡蛋果，主要分布于广西、广东等地，百香果果实富含荔枝、酸梅、柠檬等百余种水果的香气，因此被誉为“百香果”。百香果中含有多种维生素、类胡萝卜素、微量元素和氨基酸，具有抗焦虑及镇静、抗氧化、抗成瘾、抗炎等功能。现代医学表明，草莓具有滋阴养血、降血压、抗衰老等作用，可以预防动脉粥样硬化，降胆固醇，对治疗贫血症、白血病、脑出血等也有一定的疗效。

果酱是凝胶物质，其中果酸能促进消化液分泌，增强食欲；
富含钾、钙、锌等元素，能消除疲劳。近年来，由于人们对身体保健意识的不断强化，一些具有很高营养价值和保健功能的果酱深受消费者喜爱，如香蕉果酱和胡萝卜复合果酱等。目前市场上也有较多复合果酱产品，如刘芳舒等采用番茄与无籽刺梨生产无籽刺梨复合果酱；
尤丽新等制备得到香蕉猕猴桃复合果酱；
李自强等以金雀花浆、红枣泥和胡萝卜泥为主要原材料生产制备出低糖金雀花复合果酱。果酱产品种类繁多，然而在市场上却很少见到具有抗氧化功能的果酱。大多数体外抗氧化活性研究表明，蔬菜和水果对不同自由基具有一定的清除作用。蔬菜和水果的抗氧化作用除了来源于众所周知的抗氧化物质(如V、V、β胡萝卜素等)之外，可能更主要来源于黄酮、多糖等物质。枸杞、草莓、百香果富含V、黄酮、多糖等抗氧化活性物质。笔者选取枸杞、草莓、百香果、白砂糖为原料，制备功能性复合枸杞果酱，运用单因素试验与Box-Behnken试验方法确定果酱制备的最优工艺条件；
通过测定ABTS、DPPH、抗超氧阴离子、羟自由基清除率及铁离子还原能力，评价果酱的体外抗氧化能力，并测定复合果酱中主要抗氧化活性成分黄酮、多糖、V的含量，以期为功能性复合枸杞果酱产品的开发提供科学依据。

草莓、百香果、白砂糖，市售；
枸杞，产于青海柴达木；
ABTS试剂，北京酷尔化学科技有限公司；
DPPH试剂，南京奥多福尼生物科技有限公司；
NaAc-HCA缓冲液，福建厦门海标科技有限公司；
超氧阴离子自由基试剂盒、羟自由基测试盒、铁离子还原能力试剂盒，南京建成生物工程研究所。其他试剂均为分析纯。

HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；
JM-B3003型电子天平：诸暨市超泽衡器设备有限公司；
UV-2600 紫外可见分光光度计：岛津企业管理有限公司。

制备工艺流程。原料选择→清洗→去皮→切块→打浆→熬煮→装瓶密封→灭菌→冷却→复合枸杞果酱。

操作要点。原料选择：选择果实较大、成熟、无破损的枸杞、草莓、百香果。打浆：将枸杞、切块的草莓、去皮的百香果按比例打浆。

熬煮：将打浆后的果酱倒入锅中，加入200 mL蒸馏水和按照要求称取的白砂糖，在电磁炉上熬煮15 min，直至果酱状态黏稠，且具有一定的流动性。装瓶密封：果酱浓缩结束后，趁热装入已灭菌的罐内(顶间隙约2～3 mm)，装瓶时要迅速将罐盖拧紧，且每锅果酱的分装要在30 min内完成。灭菌：将密封好的果酱进行灭菌，温度100 ℃，保持10 min，然后取出。

单因素试验。固定其他因素及水平，以感官评分为考察指标，分别研究白砂糖添加量、百香果添加量、草莓与枸杞配比对复合枸杞果酱感官评分的影响。设计各因素水平：白砂糖添加量3%、6%、9%、12%、15%；
百香果添加量2%、4%、6%、8%、10%；
草莓与枸杞配比2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2。

响应面试验。在单因素试验的基础上，以复合枸杞果酱感官评分为响应值()，以百香果添加量()、白砂糖添加量()、枸杞与草莓配比()为试验因素，利用Design Expert 7.0.0软件，设计3因素3水平的Box-Behnken响应面试验，并对结果进行分析。因素水平设计见表1。

表1 因素水平设计

在单因素试验的基础上，以复合枸杞果酱感官评分为主要参考指标，评判标准参照国标GB/T 22474—2008《果酱》，从色泽、香味、组织状态、黏稠度、口感、酸甜度6个方面对所制备的复合枸杞果酱进行感官评价。具体评价指标见表2。

黄酮含量的测定。参考前人方法绘制芦丁标准曲线。以吸光值与芦丁标准品浓度(g/mL)进行线性回归，得到回归方程：=55769 0+3046 7，=0998 1，并根据标准曲线计算样品中黄酮浓度，按公式计算黄酮含量。

式中,为标准曲线查得的样品黄酮浓度,g/mL；
为稀释后移取样品溶液体积,mL；
为稀释倍数；
为称取样品质量,g。

多糖含量的测定。参考文献[18]采用苯酚-硫酸法绘制葡萄糖标准曲线。以吸光值与葡萄糖标准品浓度(g/mL)进行线性回归，得到回归方程：=16318 0+0005 3，=0999 7，并根据标准曲线计算样品中多糖浓度，按公式计算多糖含量。

式中,为标准曲线查得的样品多糖浓度,g/mL；
为移取稀释后样品溶液的体积,mL；
为稀释倍数；
为称取样品质量，g。

表2 复合枸杞果酱感官评价标准

V含量的测定。参考前人的方法绘制V标准曲线。以吸光值与V标准品浓度(g/mL)进行线性回归，得到回归方程：=96840 0+0022 2，=0999 4。并根据标准曲线计算样品中V浓度，按公式计算V含量。

式中,为标准曲线查得的样品V浓度,g/mL；
为移取稀释后样品溶液的体积,mL；
为稀释倍数；
为称取样品质量,g。

ABTS自由基清除率的测定。精确称取制备得到的复合枸杞果酱，用蒸馏水将其稀释为不同质量浓度(24、48、128、160、192 mg/mL)，与ABTS溶液按照1∶20(∶)进行混合，混合后的溶液室温下避光静置6 min后，在734 nm处测定吸光值，以V为阳性对照，并按公式计算ABTS自由基清除率。

式中,为ABTS溶液的吸光值，为样品加ABTS溶液的吸光值。

DPPH清除率的测定。精确称取制备得到的复合枸杞果酱，用蒸馏水将其稀释到不同质量浓度(1.5、3.0、6.0、12.0、24.0、48.0 mg/mL)，与DPPH溶液(5×10mol/L)按照1∶1(∶)混合，室温下避光静置30 min后，在517 nm处测定吸光值，以V为阳性对照，并按下式计算DPPH自由基清除率。

式中，为DPPH溶液的吸光值，为样品加DPPH溶液的吸光值。

超氧阴离子自由基作用的测定。精确称取制备得到的复合枸杞果酱，用蒸馏水将其稀释到不同质量浓度(1、3、6、12、24、48 mg/mL)，根据试剂盒操作步骤测定样品超氧阴离子自由基清除率。

羟自由基清除率的测定。精确称取制备得到的复合枸杞果酱，用蒸馏水将其稀释到不同质量浓度(1、3、6、12、24、48、96 mg/mL)，根据试剂盒操作步骤测定样品羟自由基清除率。

百香果添加量。从图1可以看出，当百香果比例为6%时，感官评分最高，为85.7分，此时百香果的果味浓郁，酸甜度适中。百香果比例小于6 %时，百香果的果味较淡，果酱味道偏甜；
当百香果比例大于6 %时，百香果的果味偏浓，偏酸或过酸。

图 1 百香果添加量对复合枸杞果酱感官评分的影响Fig.1 Effect of thyme addition on the sensory score of compound wolfberry jam

白砂糖添加量。由图2可知，当白砂糖添加量为9%时感官评分最高，为85.2分，且果酱凝胶良好，黏稠度适中，酸甜度适中。而白砂糖添加量小于9% 时，虽然果酱基本形成凝胶，但黏稠度较小，偏酸；
当白砂糖添加量大于9%时，果酱凝胶良好，但是较黏稠，偏甜或过甜。

图2 白砂糖添加量对复合枸杞果酱感官评分的影响Fig.2 Effect of white granulated sugar addition on the sensory score of compound wolfberry jam

草莓与枸杞配比。由图3可知，草莓与枸杞配比为1∶1时的感官评分最高，为86.8分，该配比下果酱口感细腻，色泽均匀，草莓味道适中。而草莓与枸杞配比为2∶1和3∶2时，果酱口感细腻，色泽较均匀，但草莓味较浓厚；
当草莓与枸杞配比为2∶3和1∶2时，果酱口感细腻，色泽较均匀，但草莓味过淡。

图3 草莓与枸杞配比对复合枸杞果酱感官评分的影响Fig.3 Effect of the ratio of strawberry and wolfberry on the sensory score of compound wolfberry jam

表 3 Box-Behnken试验设计及结果

表4 方差分析结果

曲面分析。根据回归方程利用Design-Expert 7.0.0软件，作出各因素两两交互作用Box-Behnken及等高线(图4)。通过对3个曲面的观察可以预测和检验变量的响应值以及确定变量之间的相互关系，Box-Behnken越陡，反映出各因素之间的两两交互作用越显著。交互项(百香果添加量与白砂糖添加量)、(白砂糖添加量与草莓与枸杞比例)对果酱感官评分影响显著，、和对感官评分的影响均呈现抛物线趋势，即各因素在所选取的试验范围内，响应值存在极大值。

图 4 各因素交互作用对复合枸杞果酱感官评分的影响Fig.4 Effect of the interaction of various factors on the sensory score of compound wolfberry jam

验证试验。由Design Expert 7.0.0 软件得出的复合枸杞果酱的最佳制作条件：百香果添加量8%、白砂糖添加量7.18%、草莓与枸杞比例3∶2，该条件下所制作复合枸杞果酱的感官评分最高，为89.64分。

产品质量指标。

感官指标。制备得到的复合枸杞果酱，紫黑色有光泽，酸甜适口，柔滑细腻，香气独特(具有枸杞和百香果复合后的特殊香气)，果酱外观良好，无汁液析出，流散缓慢。

理化指标。制备得到的复合枸杞果酱，pH为4.2，黄酮含量为9.51 mg/g，多糖含量为0.49 mg/g，V含量为0.20 mg/g。

微生物指标。制备得到的复合枸杞果酱，菌落总数<100 CFU/g；
大肠菌群≤300 MPN/kg；
致病菌，未检出。

对ABTS自由基的清除效果。从图5可见，随着果酱浓度的增加，对ABTS的清除率呈上升趋势。当果酱浓度为192 mg/mL时，ABTS的清除率达81.61%。

图5 不同浓度复合枸杞果酱对ABTS自由基的清除率Fig.5 ABTS radical scavenging rate of compound wolfberry jam with different concentration

对DPPH自由基的清除效果。从图6可见，随着果酱浓度的增加，DPPH清除率呈增大趋势。当果酱浓度为48.0 mg/mL 时，DPPH清除率达89.90%。

图6 不同浓度枸杞果酱对DPPH自由基的清除率Fig.6 DPPH radical scavenging rate of compound wolfberry jam with different concentration

对超氧阴离子自由基的清除效果。从图7可见，随着果酱浓度的增加，对超氧阴离子自由基的清除率呈增大趋势。当果酱浓度为48 mg/mL时，对超氧阴离子自由基的清除率达42.82%。

图7 不同浓度枸杞复合果酱对超氧阴离子自由基的清除率Fig.7 Superoxide anion radical scavenging rate of compound wolfberry jam with different concentration

对羟自由基的清除效果。从图8可见，随着果酱浓度的增加，羟自由基的清除率呈现上升趋势。当果酱浓度为96 mg/mL 时，对羟自由基的清除率达到87.53%。

图8 不同浓度复合枸杞果酱对羟自由基的清除率Fig.8 Hydroxyl radical scavenging rate of compound wolfberry jam with different concentration

该研究以百香果和白砂糖调节果酱的糖酸比，而传统调节糖酸比采用柠檬酸与白砂糖，用百香果代替柠檬酸，打破了传统果酱的工艺制法，减少了果酱中添加剂的使用量。其次通过单因素和Box-Behnken试验确定了复合枸杞果酱制备的最优工艺条件，并且研究其体外抗氧化活性，发现果酱具有较好的抗氧化能力，可为功能性复合枸杞果酱产品的开发提供一定的参考。