水产品中孔雀石绿质控样品的制备和稳定性测试

马瑞欣，周 凡，王晓静，李雪萍，宋子瑾，张鹏燕

(1.河北省水产技术推广总站，河北 石家庄 050035；
2.河北省水产品质量检验监测站，河北 石家庄 050035)

实验室质量控制是为了将分析测试结果的误差控制在允许限度内所采取的控制措施，包括实验室内质量控制和实验室间质量控制。实验室内质量控制是实验室分析人员对测试过程进行自我控制，保证数据稳定性的重要措施；
实验室间质量控制，包括实验室间比对和能力验证，是发现和消除实验室间存在的系统误差，保证数据准确性的重要措施。实验室质量控制的结果通过质控样品的测试数据反映。

质控样品是插入分析批中与检测样品一同经历同样检测过程的样品，实验室可使用有证标准物质、采用特定方法准确赋值后的材料、实验室在确认自身条件可靠的情况下得到准确含量或浓度的样品作为质控样品。质控样品一般有两种：一是在样品中加入已知量的标准物质成为加标样品；
二是选用与被测样品基体相同或相近的实物标准样。

孔雀石绿(MG)是水产养殖中的禁用药物，是水产品质量安全检测中一个非常重要的参数。孔雀石绿在鱼体内迅速代谢为隐色孔雀石绿(LMG)，隐色孔雀石绿消除缓慢，适宜作为监测孔雀石绿的标志物。在孔雀石绿检测的质量控制中，不少检测人员遇到了回收率不满意的结果。本文探讨孔雀石绿及隐色孔雀石绿质控样品的两种制备方法，并测试了质控样品的稳定性，以期对孔雀石绿实验室内质量控制和实验室间质量控制提供帮助。

1.1 主要仪器与材料

LC-20AD液相色谱仪(日本岛津)、QTRAP 4500 三重四极杆质谱仪(美国AB SCIEX)、JR06C-200碎肉机(苏泊尔)。

草鱼/鲤冷冻肉糜，草鱼/鲤鲜肉糜，新鲜草鱼、鲤和罗非鱼。

1.2 试样制备

1.2.1 加标样品 选用未检出的草鱼肉糜和鲤肉糜样品，每个样品分别称量3份，每份5.00 g，加入MG和LMG各10 ng，涡旋混匀，制备成平行样品。冷冻肉糜加标样品在加标第1天、第3天和第5天测定其回收率。第1天的测试在放置30 min后检测，第3天和第5天的测试样品-20 ℃保存，测试前取出室温解冻后检测。冷冻草鱼肉糜加标样品共测试45个，冷冻鲤肉糜加标样品共测试50个。新鲜或冷鲜草鱼和鲤在加标后的第2天、第4天、第6天进行测试，新鲜草鱼共测试34个，新鲜鲤共测试42个。

1.2.2 实物样品 取鲜鱼类的脊背肉，切成5～6 cm肉块，分别用MG 100 μg/L的水溶液和LMG 100 μg/L的水溶液浸泡草鱼、鲤和罗非鱼的肌肉，MG和LMG溶液的用量按溶液的体积(mL)与鱼肉质量(g)比为1∶1使用，浸泡时间分别为1、2 h和4 h，之后取出，用吸水纸吸干表面水溶液，切成小块，混匀，绞成肉糜，-20 ℃保存待用。

1.3 检测方法

采用GB/T 19857-2005中的液相色谱-串联质谱法。

2.1 加标样品

2.1.1 冷冻肉糜加标样品 冷冻草鱼肉糜加标样品测试回收率结果见图1；
冷冻鲤肉糜加标样品测试回收率结果见图2。回收率70%～120%为合格，不合格的数量占比见表1。

图1 冷冻草鱼样品加标回收测试结果

图2 冷冻鲤样品的加标回收测试结果

表1 回收率不合格统计表 %

综合分析上述图表可以看出：(1)不论是草鱼还是鲤，LMG或者保持回收率稳定，或者回收率呈现连续下降趋势；
而MG或者保持回收率稳定，或者回收率呈现波动状态。说明实验室间质量控制宜选择LMG作为测试参数，不宜选择MG作为测试参数。(2)选用冷冻样品制备LMG加标质控样，鲤样品的回收率及稳定性优于草鱼样品。

2.1.2 鲜肉糜加标样品 鲜草鱼肉糜加标样品回收率测试结果见图3，鲜鲤肉糜加标样品回收率测试结果见图4。

图3 鲜草鱼样品加标回收测试结果

图4 鲜鲤样品加标回收测试结果

鲜草鱼34个样品中有2个样品LMG回收率低于70%；
鲜鲤42个样品LMG回收率全部满足要求。两组样品MG的回收率出现较大波动，特别是草鱼的C1-C4和鲤的L4-L19出现第一次回收率偏低，第二次或第三次回收率偏高，是因为在测试过程中发现内标加入后放置时间的长短对MG检测结果的影响很大而对LMG没有影响，后经实验进行了证实，因此草鱼的C5-C34和鲤的L20-L42注意控制了内标加入后放置时间保持比较一致，数据能够反应样品的回收率和稳定性。从C5-C34和L20-L42数据分析可知，MG的稳定性和回收率仍不及LMG，但经过筛选也可以找到适合做实验室内部质量控制和实验室间质量控制的合适样品，且鲤满足要求的几率比草鱼大。建议在选择MG作为实验室间质量控制的测试参数时，应在作业指导书中明确要求加入内标后的放置时间，否则MG检测结果无法评定。图5是某次能力验证中MG和LMG 的测试结果，共计38家单位参加测试，LMG回收率在70%～120%范围的有31家，MG只有14家，且数据分散性很大。

图5 能力验证中MG和LMG测试结果

分析鲜鱼糜加标样品的测试结果可知：鲜草鱼和鲜鲤鱼加标样品的稳定性较冷冻草鱼和冷冻鲤加标样品的稳定性好，鲜鲤加标样品的稳定性更好。鲜鱼糜加标样品的 MG稳定性和回收率不及LMG，宜选择LMG作为实验室间质控测试参数。选择MG作为实验室间测试参数时，应明确要求加入内标后的放置时间。

综合分析加标样品的测试结果可以看出：样品的个体差异是导致MG和LMG检测值出现较大变化的主要原因，MG和LMG检测值的变化并非二者之间的转化，可能是发生了降解反应。

2.2 实物样品

实物样品在一段时间内的稳定性检测结果见图6和图7。

图6 孔雀石绿水溶液(100 μg/L)浸泡的样品检测结果

图7 隐色孔雀石绿水溶液(100 μg/L)浸泡的样品检测结果

由图6分析得知：用MG水溶液浸泡后，都可以检出LMG，罗非鱼转化最显著，鲤次之，草鱼最少。由图7分析得知：用LMG水溶液浸泡后，草鱼和鲤中未检出MG，而罗非鱼中可以检出少量的MG。浸泡时间越长，含量越高。

Plakas等和Srivastava等认为，MG在溶液中与氢氧根离子结合生成非离子化的、无色的醇的形式(carbinol form)，脂溶性更强，更利于通过细胞膜进入细胞并部分进行代谢；
而LMG结构类似于芳香胺，其通过细胞膜进入细胞的能力较弱。所以用MG水溶液浸泡后检测值较高，且能检测到LMG；
而用LMG浸泡后检测值较低。

由图6和图7可知：不同种类的鱼肌肉中MG和LMG的含量和转化情况均不相同。MG含量波动较大，而LMG含量稳定性较好，可以用LMG作为实验室间质量控制的测试参数。按上述方法制备了鲤肌肉LMG能力验证样品，浸泡时间为1 h，测试结果按z比分数进行判定，||≤2，表明“满意”，无需采取进一步措施；
2<||<3，表明有“问题”，产生警戒信号；
||≥3，表明“不满意”，产生措施信号。图8为用标准四分位距法做的Z值分布图，共24家单位参加测试，样品测试平均值4.56 μg/kg。其中22家结果满意，1家有“问题”，1家结果不满意。

图8 LMG实物样品能力验证结果Z值分布图

通过实验比较和实际运用，可以得出以下结论：(1)两种质控样品的制备方式均表明孔雀石绿检测值稳定性比隐色孔雀石绿差，如进行实验室间能力验证，由于时限较长，建议选择隐色孔雀石绿作为测试参数。(2)选择加标样做为质控样时，宜选用未检出的鲜肉糜；
选择实物样品作为质控样时，应注意样品品种、药物浓度、药浴时间、药物转化等问题。(3)进行加标质控样品的制备时，应考虑样品的品种和个体差异。就鲤和草鱼而言，鲤较适宜。(4)加标样可以保证平行样检测数据良好的精密度，实物样品在制成肉糜的过程中，由于肉类的黏性较大，均匀性较难保证完全一致，导致检测结果的复现性较差些，见图6。可以通过制成冻干粉使得均匀性得到改善，但制备成本会增加。(5)肉糜中不存在MG和LMG的相互转化，鲜肌肉块中存在二者的相互转化，可能是由于二者的转化是在细胞内完成所致。