淋病奈瑟菌231例聚合酶链反应检测分析 淋病奈瑟菌

　　【关键字】淋病；淋病奈瑟菌；聚合酶链反应 　　【中图分类号】R759.2 【文献标识码】A 　【文章编号】1005-0515(2010)2-027-02 　　
　　淋病(Gonochea)是由淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae，NG)引起的泌尿生殖系统化脓性感染，居我国性传播性疾病发病率的首位。目前实验室主要采用外生殖器分泌物或脓液涂片染色镜检与淋球菌培养的方法，其检出率较低，特别是对慢性淋病患者易出现假阴性。聚合酶链反应(PCRl是采用分子生物学技术而建立的一种新的检测方法，针对淋病奈瑟菌具有敏感度高，特异性强，而且检测速度较快的优点。本文对我院231例经PCR检测淋病奈瑟菌一DNAfNG-DNAl的结果进行回顾与分析。总结其检测特点，现报告如下。
　　
　　1　材料与方法
　　
　　1.1　材料来源标本来自2002年8月～2005年8月我院皮肤科、性病科的231例患者。包括男性53例，年龄18-68岁；女性178例，年龄3-54岁。
　　1.2　标本采集方法①男性患者中，如尿道口脓性分泌物较多，以特质小头棉签(灭菌后使用)蘸取；对无脓性分泌物患者，暴露其尿道口，用上述棉签插入尿道约1.0～1.5cm，旋转，稍停数秒后取出，分别将收集之标本棉签置于盛有无菌生理盐水的lml离心管内，编号、登记，并记录有关症状体征。②女性病人由妇产科医师用窥阴器扩开阴道后，用无菌棉签在阴道后穹隆部旋转一圈，并停留数秒钟，同时拭取尿道口分泌物，置于无菌生理水lml的带塞试管内，立即送检。
　　1.3　仪器及试剂①美国产PCR基因扩增仪(sABC-PCR)。TGI-16B台式离心机。③XK96-B快速混匀器(江苏)。④DYY-Ⅲ-5型稳压稳流电泳仪及DYY-31型电泳槽(北京)。⑤UV-150紫外透射分析仪(北京)。⑥试剂采用淋球菌PCR检测试剂盒(NG-DNA PCR KIT 20T／KIT)，洛阳华美生物工程公司。
　　
　　1.4　方法 吸收收集的阴道或尿道分泌物标本上清夜300μl以14000r／min离心5min，弃去上清液，加入裂解液50μl充分振荡混匀，在沸水中裂解15min，14000dmin离心5min，取上清液2μl及液体石蜡2滴)，同时作阳性对照(上述混合物管内加入阴性对照物2μl)，放人PCR扩增仪内，94℃预变性5min后经94℃45s，55℃45s，72℃45s，35个循环，72℃延伸300s(5min)，取扩增物20μl于预先制好琼脂糖凝胶板上，80-100mv电泳15min于外线透射分析仪上。与阳性对照区带相同清晰规则整齐明亮较窄的区带判为阳性，否则为阴性。
　　
　　2　结果
　　
　　采用PCR技术检测NG-DNA共231份标本，检测结果见附表。
　　
　　3　讨论
　　
　　3.1　淋病的传染源为带菌者或淋病患者，传播途径为性传播和母婴传播。通过不洁性交，NG在尿道粘膜定植感染形成急性化脓性感染，潜伏期3-7天，男性表现为淋球菌性尿道炎症状，如尿急，尿痛，尿频，尿道口脓性分泌物，严重者红肿，尿道口外翻等，尿道因慢性炎症可致狭窄。本组年龄18～68岁的23例中，21例年龄分布在24～47岁之间，均有嫖娼史。本组女性患者NG-DNA阳性38例，13例为宾馆或饭店服务员，除有尿急，尿痛，尿频等症状外，还有白带增多，脓性白带，阴道壁充血红肿等，表现为急性淋球菌性阴道炎。慢性淋球菌性阴道炎可无症状，成为病原菌携带者。
　　3.2　PCR是一项特异性强。灵敏度高的分子生物学检验技术。我科自2002年8月开展PCR技术以来，获得了较好检测效果。通过几年的工作实践，我们认为在实施操作过程有以下几点需注意：(1)标本应新鲜：由于淋球菌比较脆弱，对外界抵抗力较弱，菌体易自溶等特性，因此所采集的标本应尽量及时进行检测。本文有2例标本做革兰染色找到NG，隔日后做PCR-DNA则为阴性。(2)PCR整个操作过程要求严格无菌，工作室分试剂准备区，样品处理区，基因扩增区，产物分析区，彼此隔离，不得反响。操作时穿隔离衣，戴手套，口罩，做好自身防护。离心管，一次性吸嘴，用后弃去。尽量减少污染的的机会及假阳性出现。(3)观察结果时应仔细鉴别真假区带：阳性区带整齐规划，清晰，明亮，较窄与阳性对照呈平行位置，如金条状；假区带即引物带，较宽，模糊，不慎透亮的区带与阳性对照不呈明显平行状。每次检测时应做阳性对照。(4)琼脂糖凝胶浇三次板后，不能反复使用，电泳槽内电泳液三次后及时更换。否则影响结果的准确性。
　　本文实验结果显示，在标本含菌量较少，用革兰染色和细菌培养不能检出淋球菌的情况下。对可疑淋病阳性标本，采用PCR方法检测NG-DNA更具有灵敏度高，特异性强等优越性。